This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. Il blocco della replica con FROS <ol><li> Indurre la replica Blocco <ol><li> Diluire una coltura fresca durante la notte di E. coli ceppo portante una matrice TETO e pKM1 18 a OD 600nm = 0.01 in un mezzo complesso diluita (0,1% triptone, 0,05% estratto di lievito, 0,1% NaCl, 0,17 M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4) con antibiotici come richiesto per la selezione. Nota: non aggiungere tetraciclina per la selezione in quanto non è compatibile con questo sistema. Rendere il volume della coltura equivalente a 10 ml per campione richiesto. Ad esempio, il volume di coltura per il disegno sperimentale in figura 1 è di 60 ml. </li><li> Crescere a 30 ° C con agitazione fino a OD 600 nm = 0,05-0,1. Rimuovere un campione di 10 ml per servire come controllo uninduced e aggiungere 0,1% arabinosio alla cultura rimanente per indurre la produzione di TetR-YFP da pKM1. Continuare a crescere sia il non indotte e indottoculture. Dopo 1 ora, verificare la presenza di un unico punto focale all&#39;interno di ogni cellula della cultura indotta utilizzando la microscopia a fluorescenza (vedere paragrafo 2). </li><li> Se le cellule indotte sono confermati bloccato (oltre il 70% delle cellule hanno un unico fuoco), registrare l&#39;600nm OD e prendere un campione di 7,5 ml per l&#39;analisi gel 2-D (vedi sezione 3). Prendere un campione equivalente dalla cultura di controllo non indotte. </li></ol></li><li> Rilasciando la replica Blocco <ol><li> Per rilasciare il blocco di replica, aggiungere 100 ng ml -1 del anhydrotetracycline induttore gratuita (AT) per un campione di cellule bloccate 10 ml. Continua a crescere a 30 ° C per 10 min e prelevare campioni di densità cellulare (1 ml), analisi al microscopio (10 microlitri) e neutro-neutro gel di agarosio 2-dimensionali (7,5 ml). </li></ol></li><li> Indurre Crollo del replisoma <ol><li> Se le celle contengono un allele sensibile alla temperatura, come ts dnaB o TS dnaC che richiede deactivazione, spostare il pallone contenente le cellule bloccate a 42 ° C. Prelevare campioni per analisi in momenti richiesti (ad esempio, 1 ora dopo l&#39;incubazione). Dopo che le cellule sono incubate a 42 ° C per 1 ora, spostare le cellule a 30 ° C per 10 min (vedere Figura 1). Nota: Le cellule possono essere spostati a 30 ° C per l&#39;analisi riavvio. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Figura 1:. Panoramica sulla procedura di blocco e di rilascio sperimentale FROS replica E. ceppi coli che trasportano l&#39;array Teto sono coltivate a 30 ° C. Quando le cellule raggiungono un 600nm OD superiore a 0.05, produzione TetR-YFP è indotta con arabinosio (ara; 0,1%). Continua a crescere una sottopopolazione di cellule indotte ad agire come controlli a 30 ° C. Un campione di cellule indotte viene analizzata tramite microscopia a fluorescenza dopo 1 - 2 h (vedere 2.1). Se la replica èconfermato di essere bloccato, vengono prelevati campioni per l&#39;analisi del gel 2-D indicata dalle provette (vedi 3.1) e test di vitalità (opzionale). Il blocco replica può essere rimosso con anhydrotetracycline (AT; 0,1 mg / ml) e le cellule analizzate 10 min più tardi. Se le cellule portano un allele sensibile alla temperatura (ad esempio dnaB ts), questo può essere inattivato spostando le cellule bloccate a 42 ° C per l&#39;analisi del caso. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. microscopia a fluorescenza <ol><li> Preparare un tampone agarosio pipettando 500 ml di agarosio fuso (1% in acqua) su un vetrino da microscopio; sovrapporre il vetrino immediatamente prima delle solidifica agarosio. Conservare la slitta (s) in tessuti bagnati a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Quando l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino dal pad agarosio e pipetta 10 ml di battericultura sul centro del pad per impedire il movimento delle cellule durante la visualizzazione. Una volta che il campione è essiccato (circa 5 minuti), sostituire il vetrino. Mettere una goccia di olio di immersione sul vetrino e porre il vetrino sotto l&#39;ottica. </li><li> Visualizzare le cellule con la funzione Phase Microscopia a 100X ingrandimento. <ol><li> Nella finestra di dialogo Acquisisci all&#39;interno del software di imaging, impostare il tempo di esposizione a 100 msec. Acquisire l&#39;immagine selezionando Acquire. Non spostare il palco. Nella finestra di dialogo Acquisisci, selezionare YFP come l&#39;illuminazione per l&#39;otturatore esterno collegato alla fotocamera. Impostare il tempo exporsure a 1.000 msec. Spegnere la luce della fase. Acquisire l&#39;immagine di fluorescenza selezionando Acquire. Nota: Il tempo può variare a seconda della fonte di luce, microscopio e fotocamera utilizzata. </li><li> Per sovrapporre la fase e le immagini fluorescenti, selezionare Colore Combina dall&#39;interno del menu Display. Nella colore Combina finestra di dialogo, selezionare l&#39;immagine YFP come l&#39;immagine di fase come il bl componente verde ecomponente ue. Fare clic sul colore combinare. Determinare se la popolazione ha avuto replica bloccato da stabilire se la maggior parte delle cellule hanno un fuoco per cella. Nota: confronto ad un campione dal controllo senza arabinosio aggiunto è utile per identificare visivamente la differenza nella produzione EYFP. </li></ol></li></ol> 3. Spine DNA Estrazione / Agarose <ol><li> Aggiungere azide di sodio (concentrazione finale dello 0,1%) per i campioni di 7,5 ml di coltura da passi 1.1.3 e 1.2.1. Incubare in ghiaccio per almeno 5 minuti. Nota: sodio azide è estremamente tossico. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese. </li><li> Centrifugare le cellule 5.000 xg per 10 minuti per far sedimentare le cellule. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di Pett IV (PIV) tampone (10 mM Tris: HCl (pH 8.0), 1 M NaCl). Microcentrifuga (13, 000 xg per 2 minuti) per far sedimentare le cellule. discard il surnatante. In questa fase, il processo di pellet ulteriormente o conservare a -20 ° C. </li><li> Risospendere le cellule con la più bassa densità cellulare in 50 microlitri PIV e posto a 50 ° C. Per tutti gli altri campioni, regolare il volume di PIV così la densità cellulare finale è la stessa in ogni tubo (es Campione 1 (OD 600nm = 0,128) risospeso in 50 microlitri; Campione 2 (OD 600nm = 0,138) risospeso in 54 microlitri). <ol><li> Aggiungere un volume uguale di soluzione preparata di agarosio allo 0,8% in PIV (conc finale 0,4%;. Es Esempio 1 50 microlitri, Esempio 2 54 microlitri). Assicurarsi che i campioni, agarosio e PIV sono superiori a 50 ° C per evitare la solidificazione. </li></ol></li><li> Trattare un vetrino da microscopio con 40 ml di una soluzione di vetro idrorepellente o silicone appropriata. Strofinare il vetrino con un fazzoletto di carta fino a quando è asciutto. Nota: Questo può essere fatto in anticipo e le diapositive trattati conservato a lungo termine a temperatura ambiente. </li><li> Mettere 20 gocce microlitri di tegli sospensione cellulare / agarosio sul vetrino per la produzione di tappi che sono emisferica. Nota: Il primo campione (risospeso in 50 ul PIV) produrrà 5 spine su una diapositiva. </li><li> Quando le spine hanno solidificato, farle scivolare dolcemente in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 1 ml di tampone di lisi cellulare (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M di NaCl, 100 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA), lo 0,2% di sodio desossicolato, 0,5% sale di N-Lauroylsarcosine sodio (Sarkosyl), 100 mcg ml - 1 lisozima, 50 mcg ml - 1 RNasi A). Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Rimuovere il tampone di lisi cellulare e aggiungere la soluzione 1 ml di EDTA / sarcosyl / proteinasi K (ESP) (0,5 M EDTA, 1% sale di sodio N-Lauroylsarcosine (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 proteinasi K). Incubare a 50 ° C durante la notte o fino a quando le spine sono trasparenti. Se è necessaria una seconda notte di incubazione, sostituire la soluzione ESP con tampone fresco dopo circa 18 ore. </li><li> Rimuovi ilESP tampone e lavare i tappi 5 volte con 12 ml di Tris-EDTA (TE) tampone (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), consentendo un 30 min in equilibrio con ogni lavaggio. Conservare a 4 ° C in 1 ml di tampone TE. </li></ol> 4. neutro-neutro 2-Dimensional elettroforesi su gel <ol><li> Trasferire una spina agarosio dal punto 3.8 a una provetta per microcentrifuga fresco e aggiungere 150 ml di tampone enzima di restrizione (1x concentrazione). Aggiungere 25-100 unità di enzima di restrizione (ad esempio, 60 unità di EcoRV; (vedi Figura 3A)). Digest a 37 ° C per 6-8 ore. </li><li> Al 4 ° C, versare un gel di agarosio 0,4% (300 ml) in 1x Tris / borato / EDTA (TBE) in un vassoio di gel di circa 25 x 25 cm. Inserire un pettine per rendere pozzetti circa la stessa larghezza del diametro della spina. Quando il gel è impostato, rimuovere il pettine e spostare il gel a temperatura ambiente. </li><li> Infilare una delle spine agarosio digeriti in un pozzo, posizionando la slitta piatta della spina contro il lato del pozzo dove tegli DNA entrerà nel gel. Inserire una sola spina nello stesso modo in ogni secondo pozzo. </li><li> Pipettare fuso 0,4% agarosio nei pozzetti per sigillare i tappi in posizione. </li><li> Carico 1 kb scala del DNA in un pozzo vuoto, lasciando ancora un divario tra la scala e campioni, ed eseguire il gel durante la notte (16 ore, 55 V) a 1x TBE a temperatura ambiente. </li><li> Macchia il gel in un bagno di acqua contenente etidio bromuro (0,3 mg ml -1) per 20 min. Nota: il bromuro di etidio è considerato un agente mutageno potente ed una tossina. Consultare la scheda di sicurezza prima di iniziare il lavoro e non maneggiare fino a quando tutte le misure di sicurezza sono state lette e comprese. </li><li> Visualizzare il DNA con un transilluminatore UV a onde lunghe e tagliare ogni frammento corsie con una retta, anche tagliare, minimizzando l&#39;inclusione di eccesso di agarosio su entrambi i lati della corsia. Nota: Ad esempio, se il frammento di interesse è di 5,5 kb, tagliare un frammento di 7,5 centimetri per includere i frammenti di DNA da 5 kb al approximatEly 12 kb (vedi Figura 3A). </li><li> Posizionare la corsia di gel asportato in un vassoio di gel a 90 ° direzione di migrazione del DNA. Nota: Due file di 3 frammenti di gel può andare bene in un vassoio di gel 25 x 25 2 cm. La prima fila di corsie del gel è nella parte superiore del vassoio, la seconda fila a 12.5 cm. </li><li> Preparare 300 ml di agarosio per la seconda gel di dimensione (0,9% nel 1 x TBE con 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio). Quando l&#39;agarosio si raffredda a 50 ° C, pipetta la agarosio fuso attorno alle fette di gel a solidificare la loro posizione. Versare il agarosio rimanenti nel vassoio per una profondità che è almeno di livello con le fette di gel. </li><li> Una volta che il gel è solidificato, elettroforesi a 4 ° C in TBE 1x contenente 0,3 mg ml -1 bromuro di etidio a 220 V fino a quando il DNA è migrata circa 10 cm. Nota: 4 ore è sufficiente per un frammento di 5,5 kb che un frammento più piccolo avrà bisogno di meno tempo. </li><li> Asportare i blocchi in cui il DNA genomico è presente ucantare bordo di un righello di metallo, compreso il gel sopra includere il DNA non visibile (Figura 3C). </li></ol> 5. Ibridazione del sud <ol><li> soluzione Preparazione <ol><li> Preparare depurinazione tampone (0,125 soluzione M HCl). Nota: Questo buffer può essere riutilizzato ed è stabile a temperatura ambiente per 1 mese. </li><li> Preparare denaturazione tampone (1,5 M di NaCl, 0,5 M NaOH). Nota: denaturazione buffer può essere riutilizzato una volta ed è stabile per un massimo di 3 mesi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone di neutralizzazione (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris). Regolare a pH 7.5 con HCl. Nota: tampone di neutralizzazione può essere riutilizzato una volta ed è stabile per 3 mesi a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10x Saline citrato di sodio (SSC) tampone (0,15 M citrato trisodico, 1,5 M di NaCl, pH è 7 - 8) per l&#39;uso in passi 5.2.4 e 5.2.6. Da questo buffer, fare una SSC magazzino 2x (per l&#39;uso in fase 5.2.9). Nota: 10x SSC e 2x SSC unri stabile a temperatura ambiente per 3 mesi. </li><li> Preparare Chiesa e Gilbert Hybridization Buffer 19 Modified (0,5 M tampone fosfato [pH 7,2], 7% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS), 10 mM EDTA). Lasciare a 65 ° C per sciogliere completamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Trasferimento <ol><li> Sciacquare i blocchi di gel asportati in soluzione depurinazione per 10 minuti a temperatura ambiente su una sedia a dondolo o agitatore orbitale. Mantenere la velocità di agitazione basso per evitare di danneggiare i blocchi agarosio. </li><li> Risciacquare i blocchi gel brevemente con acqua distillata e quindi con tampone di denaturazione per 30 min. Risciacquare ancora brevemente in acqua distillata e quindi incubare i blocchi di gel in tampone di neutralizzazione per 30 minuti con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Tagliare una membrana di nylon alla dimensione esatta del gel (s). Tagliare un nick in alto a destra per aiutare a orientare la membrana nei passaggi futuri. Nota: Due blocchi gel (6 campioni) può essere visualizzato su una membrana. </li><li> Versare abbastanza 10x SSC in un TRay modo che non si secca durante la notte. Creare una piattaforma circa 5 cm sopra il livello del buffer. Saturare 3 fogli di carta per cromatografia 3MM con 10x SSC e posto sulla piattaforma. Tagliare la carta cromatografia in modo che sia abbastanza lungo per essere immerso in tampone a entrambe le estremità e largo abbastanza da contenere il gel membrana sulla. </li><li> Porre il gel (s) sulla parte superiore della carta cromatografia satura. Inquadrare il gel con involucro di plastica per evitare il buffer by-passando il gel durante il trasferimento. Adagiare la membrana taglio sulla superficie del gel (s). Rimuovere le bolle d&#39;aria tra la membrana e il gel rotolando una bottiglia o una pipetta sierologica dolcemente attraverso la membrana. </li><li> Tagliare tre fogli di carta cromatografia 3MM alle stesse dimensioni della membrana. Saturare i fogli di carta per cromatografia con 10x SSC e posto sulla parte superiore della membrana. Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria che si sono formate. </li><li> tovaglioli di carta Stack di almeno 5 cm sulla parte superiore della carta assorbente seguito da un supporto solido (approPeso ximate di 1 kg per una membrana 23 x 16 cm). Lasciare che il trasferimento di procedere durante la notte. </li><li> Esporre la membrana (DNA lato alto) a 1,200 J / m 2 di UV per reticolare il DNA alla membrana. Non sciacquare prima di questo passaggio. </li><li> Sciacquare accuratamente la membrana in 2x SSC per evitare fondo elevato sulle immagini macchia. Utilizzare la macchia immediatamente per l&#39;ibridazione (vedi 5.3) o asciugare a temperatura ambiente, avvolgerlo nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> ibridazione <ol><li> fornetto Preriscaldare e bottiglie a 55 ° C. </li><li> Aggiungere 100 mcg ml -1 di albumina sierica bovina (BSA) e 10 mg ml -1 DNA non specifico (ad esempio, il salmone DNA spermatico) nel buffer di pre-riscaldato ibridazione. </li><li> Per consentire anche per la copertura del tampone di ibridazione quando la membrana viene arrotolata, collocare il blot su un quadrato di dimensioni simili di rete di nylon con il lato DNA-bound della membrana rivolta verso l&#39;alto. Arrotolare la macchia lungo il suo lato lungo. Diapositivala macchia / mesh all&#39;interno di una bottiglia di ibridazione. Aggiungere una quantità appropriata di tampone di ibridazione preriscaldato a srotolare il blot (ad esempio 30 ml per un cm 2 membrana 23 x 16). </li><li> Incubare in un forno preriscaldato, ruotare le bottiglie, per 1 ora. </li><li> Preparare la sonda mescolando 50 ng purificato omologo prodotto di PCR per la regione di interesse, 150 ng di primer esameriche casuali, tampone per frammento di Klenow e H 2 O per fare un volume di 13 microlitri. Far bollire per 3 minuti poi posto immediatamente sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di 1 mm dCTP / dGTP / dTTP mix, 1 ml di frammento di Klenow (5U) e 50 pCi deossiadenosina radiomarcato 5&#39;-trifosfato sul alfa fosfati (α 32 P-dATP). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Aggiungere 1 ml di 1 mM dNTP mix e 1 ml di Klenow frammento. Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Far bollire Sonda per 5 minuti e aggiungere immediatamente ai tubi di ibridazione. Ibridare overnight a 55 ° C, con rotazione. </li><li> Decantare il prOBE dalla membrana. Nota: La sonda può essere riutilizzato una volta. </li><li> Sciacquare la membrana brevemente nel pre-riscaldato, tampone di lavaggio a bassa severità (2x SSC, 0,1% (w / v) di SDS). Aggiungere fresca tampone di lavaggio a bassa severità e incubare per 5 minuti a 55 ° C con rotazione. Ripetere. </li><li> Lavare due volte in tampone di lavaggio medio stringenza (1x SSC, 0,1% (w / v) di SDS) per 10 min a 55 ° C con rotazione. </li><li> Lavare due volte in tampone di lavaggio stringenza elevata (0.1x SSC, 0.1% (w / v) di SDS) per 5 min a 55 ° C con rotazione. </li><li> Rimuovere la membrana e tamponare con il tessuto per rimuovere il liquido in eccesso. Avvolgere nella pellicola garantire che vi sia alcun residuo di umidità sulla pellicola trasparente e posto in cassette di esposizione con uno schermo di memorizzazione fosforo pre-oscurata. Chiudere la cassetta ed esporre per almeno 2 ore prima della visualizzazione utilizzando un imager fosforo. </li></ol></li></ol>

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J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks.">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li><li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks.">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li><li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

Durante la replicazione del DNA, la replisoma affronta gli ostacoli sul DNA che compromettono la sua progressione. Danno al DNA comprese lesioni e le lacune così come le strutture aberranti possono impedire la replisoma di procedere 1. Recentemente, si è trovato che le proteine ​​legate al DNA sono la fonte più comune di impedimento alla replica progressione forcella 2. La conoscenza degli eventi seguenti l&#39;incontro del replisoma con un blocco nucleoproteina è stata precedentemente limitata dalla incapacità di indurre un tale blocco nel cromosoma di una cellula vivente in una posizione nota. In vitro analisi ha migliorato la nostra comprensione del comportamento cinetico di un replisoma attiva quando incontra un blocco nucleoproteina 3, nonché i dettagli meccanicistici della replisoma sé 4,5. Comprensione corrente della riparazione di replica viene generalmente effettuata con UV come agente dannoso e studiata utilizzando DNA plasmidico in vivo 6-8 </sup&gt;. Mentre le proteine ​​che possono essere coinvolti nella riparazione del DNA dopo incontra un blocco in vivo nucleoproteine ​​sono generalmente inteso da questi studi, se ci sono variazioni di eventi molecolari all&#39;interno delle vie di riparazione a causa della causa distinta nel blocco di replica è ancora ancora essere determinati. Qui, descriviamo un sistema che permette un blocco nucleoproteina da stabilire in una posizione specifica del cromosoma con un System Operator Repressor fluorescente (FROS). Utilizziamo un ceppo di E. coli che ha avuto una serie di 240 siti Teto incorporati nel cromosoma 9. Ogni sito Teto all&#39;interno della matrice ha un 10 bp sequenza casuale fiancheggiante di aumentare la stabilità della matrice impedendo ricombinazione RecA mediata all&#39;interno della matrice. Questo array, e variazioni di esso, sono stati inizialmente utilizzati per comprendere E. coli dinamica dei cromosomi 10,11, ma sono stati poi adattati alle Prevent in vivo la replicazione 12. L&#39;array è stato trovato per essere stabilmente mantenuto e per bloccare quasi il 100% delle forcelle di replica quando vincolato TetR 10,12. L&#39;uso della matrice simile Laco in vitro ha trovato sole 22 siti erano sufficienti a bloccare il 90% di replica, anche se questa matrice inferiore era meno efficace in vivo 13. Per adattare la matrice per creare un blocco nucleoproteina, la proteina repressore deve essere altamente overproduced in condizioni ottimali in cui si lega poi alla matrice per creare un posto di blocco. La formazione del blocco, e il suo successivo rilascio, possono essere monitorate attraverso l&#39;uso di microscopia a fluorescenza se viene utilizzata una variante fluorescently etichettato del repressore Tet. Lo stato della replica in ciascuna cella è indicato dal numero di focolai visto, in cui un unico punto focale significa solo una copia della matrice è presente all&#39;interno della cellula e multiple foci sono indicativi di replicazione attiva. Questa ri attivaplicatura è abilitata quando il blocco nucleoproteina viene invertita mediante l&#39;aggiunta di induttore gratuito che riduce l&#39;affinità di legame del TetR per il sito dell&#39;operatore sufficientemente per la replisoma procedere attraverso l&#39;array. La proteina repressore è ancora in grado di legarsi al DNA con elevata affinità sufficiente che le società più copie della matrice possono essere visualizzati. Maggiori dettagli intricati degli eventi presso il blocco nucleoproteina può essere scoperto usando neutro-neutro elettroforesi bidimensionale agarosio e ibridazione Southern 14-16. Queste tecniche permettono l&#39;analisi di strutture di DNA nella popolazione. Gli intermedi di replica che si formano durante l&#39;evento, e potenzialmente rimangono non riparato, può essere visualizzato. Variando l&#39;enzima di restrizione e la sonda utilizzata, gli intermedi possono essere visualizzati non solo nella regione di matrice, ma anche a monte della matrice quando la forca di replicazione regredisce 17,18. Ilregressione verificatosi dopo la dissociazione replisoma; principali ed afflitte filamenti nascenti separano dai fasci modello e ricottura tra loro come i fili template contemporaneamente ri-ricottura conseguente DNA struttura a quattro vie (una giunzione Holliday). Usando questo sistema è stato dimostrato che la forcella replica non è stabile quando rileva questo blocco 18. Inoltre, derivati ​​termosensibili di componenti replisoma possono essere utilizzati per impedire ricaricare alla forcella di replicazione una volta che è collassata. Una volta che un blocco viene stabilita, il ceppo può essere spostato ad una temperatura non permissive per garantire una disattivazione sincrono del replisoma e prevenzione controllata di ricaricare. La disattivazione di temperatura indotta assicura tutte le forche all&#39;interno della popolazione sono crollati in un dato tempo e permette la valutazione di ciò che accade quando il replisoma collassa, come il DNA viene elaborata, e ciò che è necessario per riavviare il processo di replicazione del DNA. Un vantaggio del sistema descritto qui è che il blocco nucleoproteina è completamente reversibile; Pertanto, la capacità delle cellule di recuperare dal blocco nucleoproteina può essere seguita. L&#39;aggiunta di anhydrotetracycline alle cellule sarà alleviare la stretta legame del repressore, permettendo una forchetta replica di procedere attraverso la cella e per ritrovare la vitalità. Il rilievo del blocco può essere visualizzata neutro neutro elettroforesi bidimensionale agarosio dopo 5 min, e mediante microscopia entro 10 min. Inoltre, l&#39;analisi redditività può rivelare la capacità del ceppo per recuperare dal blocco replica e continuano a proliferare. Alterando il background genetico dei ceppi utilizzati nella procedura sperimentale descritta qui, i percorsi di riparazione per questo tipo di blocco possono essere chiarite.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>16922</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.364</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92144</td>
			<td>Growth media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>Growth media component; Potassium buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>For induction of TetR-YFP production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37919</td>
			<td>Release of replication bloackage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>452310</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eYFP filter set</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td>41028</td>
			<td>Visualization of YFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-AG</td>
			<td>Visualization of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph&#160; Software (Molecular Devices)</td>
			<td>SDR Scientific</td>
			<td>31282</td>
			<td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td>
			<td>Autobarn</td>
			<td>DIO1470</td>
			<td>For agarose plug manufacture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC103157P</td>
			<td>TE, TBE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>AJA180</td>
			<td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Bacteriostatic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>TE buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5125</td>
			<td>Cell lysis and ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6513</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>6300</td>
			<td>Cell lysis buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>AM0706</td>
			<td>ESP buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sub-Cell Model 192 Cell</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704507</td>
			<td>Electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator 2000</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708110</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610433</td>
			<td>Visualization of DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL20185.360</td>
			<td>TBE component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond-XL nylon memrbane</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>RPN203S</td>
			<td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3MM Whatman chromatography paper</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>3030690</td>
			<td>Southern blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>95-0031-01/02</td>
			<td>Crosslinking of DNA and hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>31149</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td>Denaturation buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PROL27833.363</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>227</td>
			<td>Wash buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Hybridization buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random Hexamer Primers</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-38028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow fragment</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0212L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8217;-triphosphate-32P-ATP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>BLU502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage Phosphor Screen</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>GEHE28-9564-76</td>
			<td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35x43cm screen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td>Visualization of blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>UVP</td>
			<td>07-0194-02</td>
			<td>35 x 300mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Ostacoli presenti sul DNA, tra cui proteine ​​strettamente legate e varie lesioni, può seriamente inibire la progressione del meccanismo di replicazione della cellula. Lo stallo di un replisoma può portare alla sua dissociazione dal cromosoma, in parte o integralmente, portando al collasso della forcella di replica. Il recupero da questo collasso è una necessità per la cella di precisione completa la duplicazione dei cromosomi e successivamente dividere. meccanismi diversi Pertanto, quando si verifica il crollo, la cella si è evoluta che si svolgono per ripristinare la forcella del DNA e consentire la replica da completare con l&#39;alta fedeltà. In precedenza, questi percorsi riparazione replicazione nei batteri sono stati studiati utilizzando danni UV, che ha lo svantaggio di non essere localizzato in un sito conosciuto. Questo manoscritto descrive un sistema che utilizza un sistema di fluorescenza Repressor Operator (FROS) per creare un blocco di proteine ​​site-specific che può indurre la fase di stallo e il crollo di replica FORKS in Escherichia coli. Protocolli dettaglio come lo stato della replica può essere visualizzato in singole cellule viventi utilizzando microscopia a fluorescenza e replicazione del DNA intermedi può essere analizzato da 2-dimensionale elettroforesi su gel di agarosio. Mutanti sensibili temperatura dei componenti replisoma (es DnaBts) possono essere incorporati nel sistema per indurre un crollo sincrona delle forche di replicazione. Inoltre, il ruolo delle proteine ​​ricombinazione e elicasi che sono coinvolti in questi processi possono essere studiate usando fori genetiche all&#39;interno di questo sistema.

Il FROS è un, blocco nucleoprotein site-specific inducibile che consente intermedi di replicazione da visualizzare nelle cellule viventi 12,18. Un disegno sperimentale generale per il campionamento delle cellule è illustrato in Figura 1. I tempi di campionamento e variazioni in background genetico fanno un sistema versatile per studiare la riparazione di un tale blocco. Lo schema illustra come mutanti sensibili alla temperatura, come ad esempio ts dnaB</...

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Indurre un blocco di replica siti specifici in<i&gt; E. coli</i&gt; Utilizzando un sistema fluorescente Repressor Operator

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K Views.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

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Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

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Biologia

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

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Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

Visualizzazione dei raggi UV-indotta Intermedi replica in E. coli Utilizzando bidimensionale agarosio-gel Analisi

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale

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Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l&#39;antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em&gt; E. coli</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Indurre un blocco di replica siti specifici in

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Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine di membrana in

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