This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Preparazione per la Formazione di alginato di dischi <ol><li> Preparare un 4% (w / v) soluzione di alginato a 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di aggiunta di calcio o cloruro di magnesio e posto in un bagno d&#39;acqua 37 ° C. Le concentrazioni di soluzione di alginato può variare, ma 1 - 4% (w / v) sono raccomandati soluzioni di alginato. </li><li> Mescolare la soluzione di alginato con un rapporto di 1: 1 con base mezzi di coltura cellulare caldo (ad esempio, di Dulbecco Modified Eagle Medium.) Per il tipo cellulare desiderato. La concentrazione alginato è ora metà della concentrazione iniziale, cioè., 2% (w / v). Sterilizzare alginato / soluzione multimediale utilizzando sterili 0,2 micron filtri di nylon siringa. </li><li> Preparare un bagno di sterile 102 mM cloruro di calcio diidrato in acqua sterile con soluzione sufficiente per sommergere stampi (~ 200 - 300 ml). </li><li> Raccogliere la sterile &quot;di stampo formazione di gel&quot; (6 mm di diametro x 3 mm pozzi cilindrici alti in un 3 a 3 x in lamiera di alluminio, vedere <strong&gt; Figura 1) e placche (inferiore: uno 3 x 3 in lamiera di alluminio, Top: una 1.5 in x 3 in lamiera di alluminio) e preparare stampi come segue: <ol><li> Tagliare carta spessa filtro (carta da filtro assorbente) e la membrana cellulare microsieve (10 micron dimensioni dei pori) per le dimensioni della parte superiore e inferiore piastre laterali e metterli nella vasca da bagno di cloruro di calcio fino a saturazione, circa 1 min. Se lo si desidera, sterilizzare il filtro di carta spessa e la membrana microsieve tramite autoclave o luce ultravioletta per 30 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Set-up metà (la metà inferiore) del costrutto stampo. <ol><li> Posizionare i seguenti elementi in cima l&#39;un l&#39;altro nel seguente ordine e lisciare con una spatola sterile: grande endplate (3 x 3), carta da filtro di spessore, e quindi la membrana microsieve. </li><li> Capovolgere e premere lo stampo su una pila di tovaglioli di carta per assicurare la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. </li><li> Posizionare il &quot;muffe gel&quot; con i pozzetti cilindrici in cima alla cell microsieve membrana e delicatamente fissare lo stampo insieme su due lati con legante clip sui lati destro e sinistro. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per la placca superiore (1,5 in x 3) per coprire completamente i pozzetti in seguito. </li></ol></li><li> Allestimento seconda metà (la metà superiore) del costrutto stampo. <ol><li> Posizionare i seguenti elementi in cima l&#39;un l&#39;altro nel seguente ordine e levigare: piccola placca motrice, carta da filtro di spessore, a membrana microsieve. </li><li> Invertito e premere questo metà dello stampo su una pila di asciugamani di carta per garantire la perdita di soluzione di cloruro di calcio in eccesso. Non fissare questo metà dello stampo utilizzando clip legante in questo momento. </li></ol></li></ol></li><li> cellule di coltura come raccomandato secondo le istruzioni del produttore. Raccogliere le cellule desiderate per incorporare nelle idrogel alginato strati. La densità raccomandata è 1 - 2 x 10 6 cellule / ml, ma questo può essere variata a seconda esperimenti desiderati. Nota: quando si utilizza questo metodoper fare gli strati con differenti tipi di cellule, assicurarsi di cultura due tipi di cellule in parallelo per la stratificazione. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) seminate ad una densità cellulare di cellule 1 x 10 6 / ml sarà utilizzato come esempio per il seguente protocollo. numero di cellulare e numero del disco possono essere scalati per esperimenti, se necessario. <ol><li> Una a due settimane prima incorporamento, cellule staminali seme mesenchimali ad una densità cellulare di 3.000 - 5.000 cellule / cm 2 in 10 ml di terreni di crescita basale (Dulbecco Modified Eagle Medium, 10% siero fetale bovino, 2% L-Glutammina, 1 % non-aminoacidi essenziali, 1% penicillina / streptomicina) in T-75 fiaschi. </li><li> Rimuovere media speso ogni 2 - 3 giorni e sostituire con 10 ml di mezzi di crescita basale finché le cellule sono 80 - 90% confluenti. </li><li> Per raccogliere le cellule, rimuovere i supporti spesi, e pipetta da 3 ml di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline senza cloruro di calcio aggiunto o cloruro di magnesio per sciacquare le cellule. Rimuovere questa soluzione, pipetta 3 ml di 0,25% TryPSIN-EDTA su cellule in crescita in T-75 fiaschi, e incubare per 5 min a 37 ° C. Dopo che le cellule hanno sollevato dalla superficie di adesione aggiungere 6 - 9 ml di terreni di crescita basale. </li><li> MSC centrifugare a 600 xg per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il supernatante e risospendere in: 1 - 5 ml di terreni di crescita basale. Contare le cellule utilizzando un emocitometro utilizzando istruzioni del dispositivo. </li><li> Rimuovere 1 x 10 6 cellule dalla risospensione delle cellule totali, centrifugare utilizzando le stesse condizioni, e aspirare il surnatante. </li></ol></li></ol> 2. Formazione di cellule Seeded alginato dischi <ol><li> Risospendere il pellet cellulare con 1 ml di soluzione di alginato / media sterile per ottenere una densità cellulare di 1 x 10 6 cellule / ml. La miscela di cellule-alginato sarà omogeneamente nuvoloso in aspetto quando le cellule sono mescolati in modo appropriato. </li><li> Pipettare 130 ml di miscela di cellule-alginato in sei diametro di 6 mm x 3 mm pozzi alti nella metà inferiore dello stampocostruire goccia a goccia, in modo da non creare bolle. Un leggero menisco convesso deve essere visibile sopra il bordo di ciascun pozzetto. </li><li> lisciare cautela la metà superiore del costrutto stampo usando una spatola sterile e capovolgerlo, in modo che la membrana microsieve cellulare è in cima pozzetti. Posizionare lo stampo costrutto sopra dei pozzetti, facendo attenzione a coprire i pozzetti contenenti le cellule e la miscela alginato completamente. </li><li> Sollevare il costrutto di stampo caricato e, tenendo premuto con forza sul centro, Fermaglio a molla i restanti due lati (superiore e inferiore) per fissare le due metà superiore e inferiore del costrutto stampo. Le soluzioni cell-alginato devono essere immerso saldamente in pozzetti in questo momento. </li><li> Immergere il costrutto di stampo fissato in 102 mm bagno di cloruro di calcio, facendo in modo che l&#39;intero costrutto è sommerso. Incubare nel cofano coltura cellulare a temperatura ambiente per 90 min. </li><li> Alla fine del 90 min, rimuovere il costrutto stampo dal cloruro di calcio 102 mMbagno e posto su una pila di asciugamani di carta nel cofano coltura cellulare. Rimuovere tutte e quattro le clip legante e separare le due metà del costrutto stampo. Gli idrogel formati in pozzetti non dovrebbero avere eventuali bolle e devono riempire completamente i pozzetti. </li><li> Utilizzando una spatola, accuratamente tracciare il bordo dei pozzetti contenenti gli idrogeli per allentare attentamente e incuneare le idrogel. Dopo aver rimosso i idrogel dal costrutto stampo rilasciare gli idrogeli direttamente in un bagno di 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e cloruro di magnesio. Coprire i gel completamente per lavare via la soluzione di cloruro di calcio in eccesso per 1-5 min. </li><li> Trasferire i idrogel nella soluzione basale terreni di crescita in piatto desiderato (ad es., Piastre 6 e) che copre completamente i idrogel. Incubare per almeno 1 ora in incubatrice coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 prima di passare alla fase stratificazione. Nota: Gli idrogel che contengono le cellule possono essere tenuti inincubatore di coltura cellulare indefinitamente in questo momento fino stratificazione di gel con un&#39;altra popolazione cellulare è desiderato, purché le modifiche di supporto vengono completati ogni 2 - 3 giorni. </li></ol> 3. Stratificazione di alginato di dischi <ol><li> Durante l&#39;ultima mezz&#39;ora della incubazione 1 ora, raccogliere e preparare stampi sterili e soluzioni per la ricottura i gel. <ol><li> Preparare la &quot;stampo taglio&quot; fissando uno stampo che ha pozzetti la metà dell&#39;altezza della &quot;muffe gel&quot; (da 6 mm di diametro x 1,5 mm pozzi alti in 3 x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro. </li><li> Preparare la &quot;stampo annealing&quot; fissando uno stampo che è di 3 mm di diametro maggiore del &quot;muffe gel&quot; (diametro di 9 mm x 3 mm pozzi alte in un 3 a x 3 in lamiera di alluminio) ad una placca (3 x 3 in lamiera di alluminio) con legante clip sui lati destro e sinistro. </li><li> Preparare una soluzione di100 mM citrato di sodio / 30 mM EDTA (citrato di sodio diidrato, etilendiamminotetraacetico tetrasodico dell&#39;acido sale diidrato) in acqua sterile. </li></ol></li><li> Rimuovere gel di popolazioni cellulari desiderato (in questo esempio, due dischi con hMSCs) da parte dei media nel piatto, e il luogo in pozzi &quot;di taglio di muffa&quot;. Ogni gel dovrebbe andare bene comodamente nei pozzetti con la metà del gel che sporge sopra lo stampo. </li><li> Usando un bisturi, tagliare il gel lungo la superficie dello stampo (questo intercettato idrogel a metà). Vibrazione la metà superiore del gel e metterlo in un pozzo stampo aperto. La metà del gel dovrebbe adattarsi comodamente nello stampo bene, ma ora entrambi i gel mezzo dovrebbe essere l&#39;altezza dello stampo con la superficie interna tagliata visibile. Ripetere con la seconda gel. Nota: Attenzione: solo le superfici di taglio interne formeranno dischi sovrapposti. Utilizzando le superfici esterne comporterà la metà di separazione. Si sospetta che trama dalla membrana microsieve trasferito sulla superficie del gel impedisconos successo del processo di ricottura. </li><li> Posizionare un pezzo di secca membrana cellulare microsieve sopra dei pozzetti, facendo in modo che la membrana microsieve è in contatto con tutte le metà gel essere ricotto e li copre completamente. Posizionare la carta filtro spesso sulla parte superiore della membrana microsieve, avendo cura di coprire completamente i gel. </li><li> Pipettare una soluzione di 100 mM di sodio citrato / 30 mM EDTA (sodio citrato diidrato, etilendiamminotetracetico tetrasodico dell&#39;acido sale diidrato) sulla carta filtro spesso fino a saturazione. Circa 750 ml è sufficiente per quattro pozzi. </li><li> Incubare i gel per 1 min a temperatura ambiente. Poi, rimuovere la membrana microsieve cellulare e carta da filtro di spessore e gettarli. Rimuovere le clip legante e aprire lo stampo. </li><li> Per ogni gel ricotto, trasferire uno citrato di sodio / trattato con EDTA metà del idrogel al preparato &quot;stampo ricottura&quot; con la superficie di taglio verso l&#39;alto. Questo sarà una metà del const ricottoruct. </li><li> Utilizzando una spatola, sollevare e posizionare un citrato secondo sodio / trattato con EDTA half-gel (può contenere un diverso tipo di cellula) sul gel già nel &quot;muffa annealing&quot;, lanciando questa seconda metà gel in modo che la superficie di taglio è in contatto con la superficie di taglio del gel già nel &quot;stampo annealing&quot;. </li><li> Premere delicatamente verso il basso le due gel utilizzando una spatola per eliminare eventuali bolle tra le due gel. Inoltre, riposizionare i gel come necessario per assicurarsi che essi sono direttamente sopra l&#39;altro. </li><li> Sollevare delicatamente la &quot;muffa ricottura&quot; e immergerlo nella vasca 102 mm di calcio cloruro per 30 min. Non coprire i pozzetti con una placca motrice. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 30 minuti, rimuovere il &quot;muffa ricottura&quot; e posizionarlo sulla carta assorbente. Rimuovere le clip legante e separare lo stampo dalla placca. </li><li> Utilizzando una spatola, raccogliere i gel ricotto e metterli in un 1x Dulbecco Phosphate Buffered Saline con cloruro di calcio e mbagno di cloruro di agnesium per lavare i gel. Successivamente, il trasferimento idrogel ricotto per terreni di coltura di cellule in un piatto desiderato (ad es., 6 pozzetti) per la cultura. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo un protocollo per la formazione di dischi idrogel alginato stratificate per lo studio co-colture di più popolazioni cellulari, come quelli nei tessuti fisiologicamente strati, ad esempio, la cartilagine. strutture stratificate, come la piattaforma coltura descritto, possono essere utilizzati per esaminare l&#39;interazione tra due distinte popolazioni cellulari sottoposti allo stesso ambiente coltura o sotto carico. Alginato è un polisaccaride lineare anionico che...

Compressione portanti tessuti come la cartilagine articolare o dischi intervertebrali sono costituiti da regioni tessuti eterogenei che sono fondamentali sia per la funzione biomeccanica e adeguata meccano-trasduzione nel tessuto. Non solo è l&#39;organizzazione cellulare e funzione distinta in diverse regioni, ma le matrici extracellulari (ECM) sono inoltre variazioni nella composizione e organizzazione. Ad esempio, cartilagine articolare è costituito da tre zone primarie con diversi morfologia cellulare, funzione meccanica e ECM. Le differenze a cambiare ECM al differenziale responsabilità portanti; lo strato superficiale è coinvolto soprattutto in risposta alla trazione per caricare, mentre le zone centrali e profonde sono principalmente responsabili per la risposta alla compressione 1. Allo stesso modo, nel disco intervertebrale, un nucleo polposo simile a gel è circondato da un anello di fibrosi lamellare e le cellule all&#39;interno di queste due aree distinte sperimentare diversi tipi di stimoli biofisici2. In questi tipi di tessuti, cellule e le matrici extracellulari all&#39;interno degli strati di tessuto interagiscono tra loro come il tessuto subisce e risponde a forze meccaniche. Ricapitolazione di tali strutture dei tessuti eterogenei rimane una sfida in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa, e la nostra comprensione del loro significato biologico è limitato. Vi è la necessità per la coltura piattaforme per analizzare tessuti stratificate nonché co-colture di diverse popolazioni di cellule all&#39;interno di un costrutto. In ingegneria dei tessuti cartilagine articolare, costrutti scaffold meno strati sono stati costruiti sfruttando la capacità dei condrociti zonali per depositare varia ECM per simulare i diversi strati di questo tessuto 3,4. Tuttavia, a strati costrutti idrogel forniscono un&#39;opportunità per indagare l&#39;interazione di diversi tipi di popolazioni di cellule che non hanno la capacità di formare un tessuto robusto in modo indipendente. Ad esempio, pop diversoulations di cellule staminali mesenchimali possono essere co-coltura all&#39;interno di costrutti a strati. Tali ponteggi strati sono stati utilizzati sia con condrociti e differenziazione delle cellule staminali mesenchimali per migliorare ingegneria tissutale 5. Non solo è possibile diverse popolazioni cellulari essere co-coltura in strati di idrogel simili, ma un unico tipo di cellule possono anche essere coltivati ​​all&#39;interno di strati che sono state manipolate per avere diversa rigidità o il contenuto biochimico per ottenere risposte diverse dalle cellule 6,7. Molti idrogel biomateriali differenti sono stati utilizzati per sovrapporre popolazioni cellulari per l&#39;ingegneria tissutale cartilagine come quelle realizzate con glicole polietilene o basi alcool polivinilico 7-9. Tuttavia, idrogel alginato sono uno dei biomateriali semplici da cui creare scaffold stratificate per studiare popolazioni cellulari eterogenee in co-coltura. Mentre idrogel agarosio sono anche facilmente formate, idrogel alginato hanno il vantaggio di consentire facile èolation di celle dal costrutto 3-D per l&#39;analisi delle singole celle come è stato descritto in precedenza 10. In studi precedenti, idrogel alginato bi-strati sono stati formati in fogli sottili e da questi fogli, sezioni sono state fette (ad es., Usando un punzone biopsia) per particolari applicazioni come per l&#39;analisi del contenuto biochimica o proprietà di taglio interfacciali 11,12. Un altro metodo per formare fogli sottili alginato è stato descritto con il potenziale per la stratificazione in più strati, ma richiederebbe alterazione del idrogel per l&#39;uso in test meccanici 13. Qui, vi presentiamo un metodo per la creazione di dischi riproducibile idrogel alginato bi-strati per l&#39;utilizzo in co-coltura di diverse popolazioni di cellule. Questa piattaforma disco alginato possiede diversi vantaggi. Principalmente, la forma riproducibile e piccole dimensioni è favorevole per la stimolazione meccanica delle cellule incorporati senza richiedere una biopsia punch o altra modifica fisica alla idrogel per molte applicazioni. Inoltre, la vitalità cellulare rimane elevato durante il processo di stratificazione, e dopo la formazione del gel netta separazione di due popolazioni di cellule all&#39;interno del gel è visibile senza regione di sovrapposizione iniziale.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

La figura 1 illustra la formazione e la stratificazione degli idrogel alginato. Completato gel bi-strati presentano una separazione iniziale completa di popolazioni cellulari come mostrato in Figura 2. La vitalità cellulare di cellule staminali mesenchimali umane) incorporato all&#39;interno di questi idrogel e stratificato rimane elevata e paragonabile a idrogel di massa come mostrato in figura 3. La vitalità è stata valutata dopo ri...

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Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered alginato costrutti: Una piattaforma per la cooperazione culturale delle popolazioni cellulari eterogenee

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Incapsulamento alginato di cellule staminali pluripotenti usando un ugello coassiale

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Biologia dello sviluppo

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Generazione di microsfere di alginato per applicazioni biomediche

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicina

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionale alginato-tallone coltura di cellule umane adenoma ipofisario

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

Supporto composito a matrice microgel-extracellulare per la stampa 3D embedded di costrutti neurali umani

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...