Questo lavoro è stato sostenuto dalla British Heart Foundation Borse di SZ (FS / 08/063 e FS / 15/30/31494).

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Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

La formazione di proteine ​​omo-oligomeri è un processo biologico fondamentale che regola l&#39;attività dei fattori di trascrizione, enzimi, canali ionici e recettori 25,26. È importante sottolineare che la proteina oligomerizzazione ha anche implicazioni patologiche tra cui la neurodegenerazione e malattia cardiaca aritmogena 4,27. Le metodologie descritte in questo articolo sono utilizzate per identificare le interazioni dominio-dominio che mediano la proteina self-associazione e di oligomerizzazione. Qui di seguito, si segnala alle fasi critiche all&#39;interno di ogni protocollo, e discutiamo considerazioni importanti, i limiti e la risoluzione dei problemi. Il sistema Y2H può essere impiegato prima per lo screening di potenziali partner di proteine ​​interagiscono a causa della sua proiezione relativamente elevato throughput, la facilità d&#39;uso e risultati altamente riproducibili. procedure Y2H sono effettuate in un laboratorio di microbiologia con incubatori standard (piatto o shaker) e le strutture camera di contenimento. L&#39;uso di frcellule competenti eshly preparate (punto 1.1.8) è fondamentale per alta lievito trasformazione efficienza, mentre per ottenere i migliori risultati in test β-Gal, appena cresciuta colonie di lievito (fino a 5 giorni di vita) dovrebbe essere utilizzato (fase 1.2.3). I sistemi basati su fattori di trascrizione diversi GAL4 e / o geni reporter supplementari / alternativi sono disponibili, e quindi esca e plasmidi prede devono essere abbinati con il ceppo Y2H appropriata. Alcuni ceppi devono essere coltivate in presenza di 3-ammino-1,2,4-triazolo, un inibitore competitivo della proteina HIS3, per saziare qualsiasi espressione costitutiva del gene HIS3 giornalista 7,8. L&#39;espressione di esche e di destinazione proteine ​​di fusione vanno verificate mediante immunoblotting 17. Nel caso in cui esca / proteine ​​di fusione prede sono tossici per il lievito, i livelli di proteine ​​inferiore tollerabili potrebbe essere raggiunto clonando in diversi vettori in cui esca / espressione preda è guidata da un promotore diverso. Inoltre, è essenziale assicurare tcappello proteine ​​di fusione esca / preda non vengono visualizzati autonoma l&#39;attività del gene reporter. attivazione del gene reporter autonoma può essere salvato modificando il costrutto per rimuovere la regione responsabile, o scambiando la GAL4 DNA-BD e fusioni AD per le due proteine ​​testate. Inoltre, i domini transmembrana sono meglio omessi da costrutti esca / preda perché possono indurre misfolding o mislocalization di proteine ​​di fusione in compartimenti di membrana intracellulari. Infatti, lo svantaggio principale del sistema Y2H è che le proteine ​​esca e di destinazione sono localizzati nel nucleo lievito lontano dalla loro posizione fisiologica subcellulare e potenzialmente privo specifiche modificazioni post-traduzionali, con conseguente falsi-positivi o falsi negativi interazioni 6-9 . Mammiferi sistemi di espressione eterologhi sono più adatti per lo studio delle proteine ​​di membrana integrali mammifero in termini di conformazione, modificazioni post-traslazionali e localizzazione subcellulare.Uno dei più utilizzati metodi di transfezione delle cellule è la precipitazione di fosfato di calcio, principalmente a causa delle attrezzature minimo e reagenti richiesti 11,15. Metodi alternativi, ovvero elettroporazione, liposomi, lipidi cationici e polimeri, possono garantire una maggiore efficienza di trasfezione seconda della linea cellulare e costruire usate. In generale, i principali fattori che influenzano l&#39;efficienza di trasfezione sono plasmide qualità del DNA e cellule salute / redditività. I migliori risultati si ottengono quando si utilizzano plasmide DNA della massima purezza (260 nm / 280 nm rapporto assorbanza di ~ 1,8) e cellule in divisione attivamente. Le cellule devono pertanto essere trasfettate a non più di 60 - 70% di confluenza (fase 2.1.2), perché la capacità di prendere DNA estraneo è legata alla superficie della cella esposta al mezzo 11. Inoltre, l&#39;inclusione di antibiotici nel terreno di coltura durante la transfezione (fase 2.1.3) non è consigliato a causa di aumento della morte cellulare 15. Fo precipitazione di fosfato di calcio in particolare, un&#39;attenta preparazione e regolazione del pH (da 7,05 appunto) della soluzione 2x HBS (fase 2.1.1), e la corretta formazione di plasmide DNA / calcio / complessi di fosfato di miscelazione vigorosa (fase 2.1.5) sono passaggi critici per l&#39;alta efficienza di trasfezione. In genere, l&#39;espressione della proteina da picchi di trasfezione transiente entro 24-72 ore. Una volta che le cellule vengono raccolte, procedure successive devono essere effettuate a 4 ° C per ridurre al minimo l&#39;attività della proteasi, e si raccomanda l&#39;aggiunta di inibitori della proteasi. Cellulare omogeneizzazione dovrebbe essere seguita da una fase di centrifugazione per rimuovere i nuclei a causa cromosomica del DNA può aumentare soluzione viscosità e migliorare legame non specifico. Così, omogeneizzazione con mezzi meccanici in un buffer iso-osmotica è preferito, di solito in (0,3 M) saccarosio o (150 mM) NaCl. In generale, i buffer di saccarosio-based sono noti per migliorare la stabilità proteica e ridurre il potenziale di aggregazione di proteine ​​non nativa, ma a causa di pidratazione referenziale sulla superficie di proteine, elettrostatici interazioni proteina-proteina sono favoriti. Al contrario, i buffer a base di sali influenzano la carica netta di gruppi laterali di aminoacidi caricati sulla superficie di proteine, avendo così una polarizzazione verso altre interazioni idrofobiche a base 28. Co-IP è il test biochimico più comunemente impiegato per valutare le interazioni proteina-proteina in particolare dal tessuto nativo. Il suo svantaggio principale è la necessità di anticorpi altamente specifici convalidati per l&#39;utilizzo in IP e immunoblotting 10,16,18. Pertanto, le proteine ​​ricombinanti sono spesso contrassegnati con un epitopo peptide, ad es., L&#39;influenza emoagglutinina (YPYDVPDYA) o cMyc umana (EQKLISEEDL), per cui gli anticorpi specifici ad alta affinità sono disponibili in commercio. Se desiderato, l&#39;anticorpo immunoprecipitating può essere coniugato chimicamente sulla Protein-A resina per evitarne l&#39;eluizione e rilevamento durante la fase di immunoblotting che possono oscurare la co-precipitato protein 16; per ottenere questo, abbiamo utilizzato con successo la chimica cross-linker 3,3&#39;-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. È indispensabile che appropriati detergenti è inclusa nel buffer IP e il materiale insolubile di cellule omogeneizzate viene rimosso mediante centrifugazione per minimizzare legame non specifico (fase 3.1.3). La scelta e la concentrazione del detersivo sono importanti considerazioni: detergenti più forti e / o concentrazioni più elevate ridurrà sostanzialmente non specifica vincolante, ma può anche abolire X: l&#39;interazione proteina Y, mentre le concentrazioni più basse o detergenti più lievi può consentire una interazione debole per essere osservata, ma può portare ad una eccessiva legame non specifico. Detergenti resistenza intermedi sono preferiti, ad esempio, Triton X-100 allo 0,5 -. Concentrazione 1%. Per ridurre ulteriormente il legame non specifico, una proteina neutra (ad esempio, albumina di siero bovino a 100 ug / ml) può essere incluso nel buffer IP e / o il lisato cellulare può essere pre-cleared previa incubazione con resina Protein-alone. Il numero di lavaggi deve essere ottimizzato per il X: coppia di Y testato, in genere tre 10-numero minimo di lavaggi con tampone IP (fase 3.1.9). In ogni caso, un campione co-IP con non-immuni IgG dell&#39;anticorpo immunoprecipitating dovrebbero sempre essere trattate in parallelo per servire come controllo negativo (passo 3.1.6). Il vantaggio principale della reticolazione chimica è che informa sulla composizione stechiometrica della proteina omo-oligomeri. La glutaraldeide è un cross-linker comunemente usato perché non richiede attrezzature specializzate e genera termicamente e chimicamente stabili legami incrociati tra interagenti proteine ​​19,20. Composti con gruppi amminici liberi devono essere omessi dai buffer di analisi (passo 3.2.1) perché sarà placare la reazione chimica. la concentrazione di glutaraldeide e il tempo di reazione (fase 3.2.4) devono essere ottimizzati per il complesso proteico oligomerica di interesse. Il principale svantaggio di questa tecnica, especialleato quando eseguita su preparazioni cellulari intere, è la non-specificità della reazione chimica che potrebbe produrre aggregati di proteine ​​artificiali che non hanno significato biologico. Alternative in vivo (ad es., Di fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia, di fluorescenza bi-molecolare o luminescenza complementazione) e tecniche in vitro (ad es., Le dimensioni cromatografia di esclusione, ultracentrifugazione analitica, Calorimetria isotermica di titolazione) sono disponibili per la caratterizzazione di proteine ​​auto-associazione e di valutazione di oligomerizzazione stechiometria 29,30. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi, e può essere più adatto per lo studio di una proteina specifica a seconda proteina di purificazione / stabilità e la disponibilità di attrezzature / reagente. I tre metodi complementari descritti qui in dettaglio, cioè Y2H, co-IP e cross-linking, sono stati usati in combinazione per fornire la prova convincente per RyR2 omo-oligomeformazione r in isolamento e all&#39;interno di una cellula vivente.

Scheletrico e cardiaco contrazione muscolare è innescato da sarcoplasmatico reticolo rilascio di Ca 2+ mediata da RyR. Ci sono tre isoforme RyR mammiferi con il canale funzionale composto da quattro subunità identiche. Ogni subunità RyR compone di una grande porzione N-terminale di regolamentazione citoplasmatica e una piccola parte C-terminale contenente i domini transmembrana che formano una alta conduttanza Ca 2+ pori. Intra e inter-anormale subunità interazioni alla base RyR disfunzione del canale e si traducono in neuromuscolari e disturbi cardiaci 1. L&#39;identificazione e la caratterizzazione di domini specifici coinvolti in RyR struttura: relazione funzione è quindi di fondamentale importanza per la comprensione della fisiopatologia RyR. tecniche di interazione proteina-proteina biochimici tradizionali richiedono notevoli quantità di proteina purificata, spesso prodotte in batteri. Questo non è possibile nel caso della RyR, una grande membrana protein composto da ~ 5000 aminoacidi, mentre i suoi frammenti ricombinanti non sono facilmente suscettibili di espressione batterica e purificazione. Così, sistemi di espressione alternativi che coinvolgono cellule ospiti eucariotiche sono necessari per proteine ​​integrali di membrana di mammiferi. Abbiamo già impiegato Y2H, co-IP e saggi di cross-linking per dimostrare collettivamente che N-terminale tetramerizzazione è una caratteristica strutturale che è conservato in tutto il tre mammiferi RyR isoforme 2,3. È importante sottolineare che, abbiamo scoperto che una singola mutazione puntiforme associata a malattia cardiaca aritmogena sconvolge N-terminale self-associazione e si traduce in un disfunzionale canali RyR 4. Abbiamo anche applicato queste tecniche per studi oligomerizzazione del RyR citoplasmatica C-terminale della coda 5 così come la N-terminale del canale di rilascio omologa intracellulare di Ca 2+, l&#39;inositolo 1,4,5 trifosfato recettore 2. Nel saggio Y2H, dello son tra due proteine ​​(X e Y) è misurata dalla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale (GAL4) e l&#39;attivazione di geni reporter conseguente 6-9. Due diversi vettori di clonazione sono usati per generare fusioni delle due proteine ​​testate con i due fisicamente separabili, domini indipendenti di GAL4: DNA-Binding Domain (DNA-BD) / proteine ​​X di fusione (esca) e attivazione del dominio (AD) / proteine ​​Y Fusion (target). La Y2H può essere utilizzato per verificare se una proteina interagisce con se stessa generando GAL4 DNA-BD e fusioni AD della stessa proteina. Geneticamente modificati ceppi Y2H sono GAL4 e GAL80 carente (la proteina GAL80 è un repressore di GAL4), così come TRP1 e LEU2 carente (per fornire selezione nutrizionale per esche e preda plasmidi, rispettivamente). Nel nucleo di lievito, i ricombinanti peptidi DNA-BD e AD sono portati in prossimità fisica per la produzione di un fattore di trascrizione ibrido GAL4 solo attraverso X le fusioni &#39;: Y interaction. Questo approccio consente un rapido screening genetico per individuare le interazioni proteina-proteina attraverso l&#39;attivazione trascrizionale parallela di prototrofici (codifica HIS3 per un enzima necessario per la biosintesi istidina) e cromogeno (codifica LacZ per β-galattosidasi (β-Gal)) geni reporter. Il vantaggio principale del Y2H è che è un test in vivo che rileva le interazioni proteina-proteina anche deboli o transitori. Inoltre, il rilevamento comporta il semplice utilizzo di selezione della crescita (in mezzi privi di istidina) o di un colorimetrica dosaggio (β-Gal) senza la necessità di purificazione delle proteine ​​esca e bersaglio o la generazione di anticorpi specifici. Inoltre, il Y2H può essere usata per selezionare un insieme di casuali cloni sconosciute (cDNA library cloni fusi a GAL4 AD) per nuovi partner di legame di una proteina esca, dando accesso diretto al cDNA della proteina libreria. Per estendere le osservazioni Y2H, indient tecniche biochimiche possono essere impiegate. Saggi di cross-linking in combinazione con immunoblotting Co-IP e sono metodi utilizzati per individuare le associazioni di proteine ​​in miscele di campioni complessi, ad es., Interi lisati cellulari 10. Il loro vantaggio principale è che riferiscono sulle interazioni proteina-proteina dal tessuto nativo, a differenza di altri metodi che richiedono l&#39;uso di proteine ​​ricombinanti. Proteine ​​ricombinanti possono anche essere utilizzati, tipicamente espresso in una linea cellulare di mammifero, dove possono avere le loro corretta conformazione e post-traduzionali modifiche, così come localizzazione subcellulare. Tuttavia, poiché co-IP e reticolazione sono in vitro utilizzando cellule omogeneizzate, è necessario confermare se i due partner proteici sono co-localizzati nella cellula intatta 11. Usiamo abitualmente trasfezione di cellule HEK293 di mammifero a esprimere transitoriamente mammiferi integrale di membrana e proteine ​​citosoliche con il metodo del calcio fosfato di precipitazione 2-4,12-14, Descritta in dettaglio. Questo è un modo economico per fornire in modo efficiente il DNA plasmidico all&#39;interno delle cellule, ma dipende dalla particolare linea cellulare utilizzata e confluenza cellulare, così come la purezza del plasmide DNA 11,15. Il saggio di co-IP comporta l&#39;isolamento della proteina nativa o ricombinante di interesse da lisati cellulari in condizioni non denaturanti consentano co-purificazione di partner di interazione putativi 10,16. Si richiede l&#39;uso di due anticorpi indipendenti, l&#39;anticorpo immunoprecipitating per l&#39;isolamento di proteine ​​X, e l&#39;anticorpo immunoblotting per il rilevamento di Y. socio proteine ​​Può essere utilizzato per verificare se una proteina interagisce con se stessa generando due fusioni differenti con due differenti epitopi tag (ad es., HA e cMyc). L&#39;anticorpo immunoprecipitating è legato attraverso la regione Fc Protein-A (o proteina-G, a seconda delle specie animali in cui l&#39;anticorpo è stata sollevata), cheè coniugato con agarosio (o Sepharose) resina. Proteina X viene precipitato per l&#39;anticorpo: Proteina-A resina dopo incubazione con il lisato cellulare, cioè la frazione di detersivo solubile di cellule omogeneizzate. Protein immuno-complessi vengono eluiti con SDS contenente tampone e successivamente analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting usando un anticorpo per rilevare la presenza di proteine ​​Y 17. Co-IP deve essere effettuata con proteine ​​detergenti solubili per evitare un eccessivo legame non specifico. La scelta del detersivo e la sua concentrazione, nonché il numero di lavaggi, devono essere ottimizzate per ciascun X: Y pair 10,16,18. La reticolazione viene impiegato per determinare la stechiometria del complesso proteico oligomerica. Si basa su una reazione chimica per creare legami covalenti tra protomers interagenti adiacenti, e, quindi, consente di preservare lo stato oligomerica della proteina durante la separazione SDS-PAGE. Ci sono numerosi reage reticolazionenti di varie lunghezze e la chimica di targeting diversi gruppi reattivi sulle proteine, ammine tipicamente primarie, carbossilici o gruppi tiolo. Qui, descriviamo l&#39;uso di glutaraldeide (OHC (CH 2) 3 CHO), un cross-linker omo-bi-funzionale con due gruppi aldeidici alle due estremità che reagiscono con i gruppi amminici liberi presenti in residui di lisina 19,20. La reticolazione è seguita in modo concentrazione-o dipendente dal tempo con conseguente formazione di addotti. Reazione glutaraldeide viene arrestata con idrazina (H 2 NNH 2) e campioni di proteine ​​vengono poi analizzati mediante SDS-PAGE e immunoblotting 17 per valutare il loro stato di oligomerizzazione. Dobbiamo notare che la reticolazione non induce oligomerizzazione ma semplicemente crea ponti stabili tra complessi proteici preesistenti. Considerazioni importanti quando effettuano esperimenti reticolanti comprendono la scelta di cross-linker, la sua concentrazione e tempo di reazione 19,20.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Nel sistema Y2H, l&#39;esca: preda interazione è inizialmente testato per selezione lievito crescita in terreno privo (triptofano e leucina) istidina e successivamente valutata β-Gal saggi di attività enzimatica (Figura 1). Lievito coltivate in mezzo di istidina carente ha il tasso di crescita lenta che dipende dalla forza delle esche: interazioni proteina preda. Il test β-Gal avviene nel lievito (coltivate in terreno manca solo triptofano e leucina) sia cresce su supporto solido (agar piastre) o in coltura liquida, con questi ultimi risultati quantitativi rendimento. Abbiamo utilizzato con successo il Y2H per identificare interazioni dominio-dominio all&#39;interno del RyR2, nonché partner proteici nuovi 2-4,12,21,22. Ad esempio, abbiamo proiettato una serie di sovrapposizione costrutti abbracciano l&#39;intera lunghezza della sequenza peptidica RyR2 per l&#39;interazione con un frammento N-terminale (AD4L: residui RyR2 1 - 906 fuso con GAL4 AD). 3 saggi di carta da filtro Colony-lift β-Gal prodotti vivaci colonie di lievito di colore blu solo per il BT4L: coppia di AD4L (Figura 2A), dimostrando che AD4L interagisce con se stessa, vale a dire il BT4L costruire (residui RyR2 1-906 fonde con GAL4 DNA-BD). colonie azzurri sono stati rilevati per la BT8: coppia di AD4L suggerendo un&#39;associazione secondaria più debole con l&#39;estremo dominio C-terminale (BT8), mentre il lievito co-trasformato con qualsiasi altro costrutto è rimasto bianco e quindi negativo per esca: l&#39;interazione proteina preda. Risultati quantitativi, ottenuti mediante saggi β-Gal liquidi (Figura 2B), indicati BT4L robusto: AD4L interazione equivalente in forza alla nota associazione tra la proteina p53 (pVA3) e SV40 grande T antigene (pTD1), mentre la BT8: interazione AD4L è stato notevolmente più debole (&lt;10% rispetto al controllo). Noi abitualmente eseguiamo esperimenti di co-IP (Figura 3) fopo l&#39;espressione transiente in una linea cellulare di mammifero (HEK293), come un test biochimico indipendente per rafforzare i risultati Y2H 2-4,12-14,21-24. Per verificare RyR2 N-terminale self-interazione, due plasmidi separati codificanti per i residui RyR2 1-906 contrassegnati sia con il cMyc o HA peptide epitopo (BT4L e AD4L, rispettivamente), sono stati co-trasfettati in cellule HEK293 con il metodo del calcio fosfato di precipitazione 3. La frazione post-nucleare di cellule omogeneizzata viene solubilizzato con le CHAPS detergenti, e il materiale insolubile è stato rimosso mediante centrifugazione per produrre il lisato cellulare. Il lisato cellulare, trattati con il ridurre ditiotreitolo agente, è stato poi incubato con Ab HA e perline Proteina-A sefarosio per immunoprecipitare AD4L HA-tag. Campioni Co-IP, diluiti con SDS-contenente tampone, sono stati caricati su due gel SDS-PAGE separate (1/10 e 9/10 ° split) e analizzati mediante immunoblotting con Ab HA e Ab cMyc, respectively. Successful IP diretta di AD4L (~ 100 kDa) da Ab HA è stata verificata mediante immunoblotting, ma non nel controllo negativo utilizzando non immune IgG di coniglio (Figura 4A). Importante, cMyc-tag BT4L (~ 100 kDa) è stato recuperato solo nel Ab HA IP, e non nel controllo negativo in assenza di AD4L immunoprecipitato (Figura 4B). saggi Y2H e co-IP fornito prove coerente per RyR2 N-terminale self-interazione, ma non hanno informato sullo stato di oligomerizzazione del dominio N-terminale, ossia se si forma solo dimeri o complessi più alti. Va notato che i complessi si dissociano e solo le subunità comprendente sarà rilevato mediante SDS-PAGE causa di SDS e denaturazione proteica indotta dal calore che sopprime le interazioni proteina-proteina. Per ovviare a questo, usiamo reticolazione (Figura 5) che chimicamente e stabilmente congiunge preesistente Protein oligomeri, la cui massa molecolare possono poi essere esaminati da SDS-PAGE dimensioni separazione 2-5. Ad esempio, omogenato di cellule HEK293 che esprimono cMyc-BT4L, trattati con la riduzione ditiotreitolo agente, è stato fatto reagire con glutaraldeide e analizzata mediante SDS-PAGE e immunoblotting usando Ab cMyc (Figura 6). In aggiunta al monomero (~ 100 kDa), un&#39;alta banda proteica massa molecolare di ~ 400 kDa è stato rilevato in modo dipendente dal tempo, indicando RyR2 N-terminale formazione tetramero 3. In particolare, tetramero era la specie oligomeriche predominanti, con dimero minima e bande trimeri osservati. Per determinare la massa molecolare apparente, l&#39;oligomero BT4L è stato separato a 4 - 15% gel gradiente SDS-PAGE 3. Abbiamo prodotto la curva standard ritardo di massa / gel molecolare utilizzando standard di proteine ​​con una gamma di 30-460 kDa, e abbiamo calcolato l&#39;oligomero di essere 358 kDa 15 (n = 4). Questa massa molecolare apparente è coerente con un tetramero BT4L disposti in unmodo circolare chiuso anziché in forma lineare, come previsto dalla disposizione dei quattro subunità all&#39;interno del canale nativo RyR2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> Figura 1. Y2H diagramma di flusso. Lievito, co-trasformato con esche e di destinazione plasmidi, è stato selezionato per la crescita nel medio privo di istidina e / o analizzati per β-Gal attività enzimatica. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> Figura 2. Y2H suggerisce RyR2 N-terminale del dominio Self-interazione. (A) Schema raffigurante la (esca) serie di umani RyR2 frammenti di proteine ​​sovrapposizione testati nel sistema Y2H per<html> l&#39;interazione con il costrutto AD4L RyR2 N-terminale (preda). Risultati qualitativi ottenuti da filtro colonia-lift saggi carta β-Gal sono indicati in &quot;+&quot; multipli o &quot;-&quot; per l&#39;interazione negativa test (B) di liquido quantitativa β-Gal normalizzati contro il controllo positivo (pVA3 codifica per GAL4 DNA-BD. fusione con la proteina p53; pTD1 codifica per GAL4 AD fusione con SV40 grande antigene T). Modificato da 3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> Figura 3. Co-IP diagramma di flusso. Le cellule di mammiferi, co-trasfettate con plasmidi X e Y, omogeneizzazione e detergente-solubilizzato per produrre il lisato cellulare usato nel saggio di co-IP, seguito da SDS-PAGE e immunoblotting.f = &quot;https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> Figura 4. Co-IP indica RyR2 N-terminale del dominio Self-interazione in cellule di mammifero. HEK293 cellule sono state co-trasfettate per transitoria co-espressione di cMyc-tag (BT4L) e HA-tagged dominio (AD4L) RyR2 N-terminale ( residui 1 - 906). AD4L stato immunoprecipitato con Ab HA da CHAPS-solubilizzate e ditiotreitolo trattati HEK293 lisato, che saggi di controllo, co-IP come negativi sono stati effettuati con non-immuni IgG di coniglio. Proteine ​​immunoprecipitate sono stati riscaldati a 85 ° C per 5 min e risolti a 20 mA per 3 ore attraverso separati 6% gel SDS-PAGE carichi di 1/10 o 9/10 th di campioni IP. trasferimento proteina seguito a 80 V per 2 ore su polyvinylidene membrana difluoruro, analisi immunoblotting è stata effettuata utilizzando (1: 1.000 diluizione) Ab HA (A) o Ab cMyc (B), rispettivamente, seguito da rafano perossidasi-coniugato anti-IgG di topo (1: 10.000 diluizione) e rivelazione chemiluminescente (1 min di esposizione). Un&#39;aliquota di lisato cellulare, 1/50 esimo del volume elaborato nei campioni IP, è stato incluso anche per servire standard di massa molecolare. Modificato da 3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> Figura 5. reticolazione diagramma di flusso. Le cellule di mammiferi, trasfettate con il plasmide X, sono omogeneizzati e sottoposti a reazione con glutaraldeide nel saggio di reticolazione, seguita da SDS-PAGE e immunoblotting. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> Figura 6. La reticolazione Indica RyR2 N-terminale del dominio Tetramero Formazione HEK293 cellule sono state trasfettate per l&#39;espressione transiente di cMyc-tag dominio (BT4L) RyR2 N-terminale (residui 1 - 906).. Cellulare omogeneizzato, trattati con la riduzione dei ditiotreitolo agente, è stata incubata con glutaraldeide per i punti di tempo indicato. I campioni sono stati riscaldati a 85 ° C per 5 min e risolti mediante SDS-PAGE (6% gel) a 20 mA per 3 ore. Dopo il trasferimento proteine ​​a 80 V per 2 ore su una membrana di polivinilidene difluoruro, analisi immunoblotting è stata effettuata utilizzando (1: 1.000 diluizione) Ab cMyc, seguita da rafano perossidasi-coniugato anti-IgG di topo (1:10.000 diluizione) e la rilevazione chemiluminescenza potenziata (1 min di esposizione). Monomerico (M: ~ 100 kDa) e tetramerica (T) forme sono indicati dalle frecce. Modificato da 3. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.5K Views.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

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Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

Valutazione dell'impatto dell'aggregazione proteica su Stress ossidativo cellulare nel lievito

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Ricerca

Biochimica

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

Struttura di cristallo del dominio N-terminale del recettore Ryanodine da Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

Analisi della membrana tubolare reti in Cardiac miociti da atri e ventricoli

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Bioingegneria

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, specifically to study the function of new genes/proteins associated with a disease, identified during the genetic diagnosis. For the development of such cell lines, two major issues have to be untangled: insertion of the CRISPR tools (the Cas9 and the guide RNA) with high efficiency into the chosen cells, and restriction of the Cas9 activity to the specific deletion of the chosen gene. The protocol described here is dedicated to the insertion of the CRISPR tools in difficult to transfect cells, such as muscle cells. This protocol is based on the use of lentiviruses, produced with plasmids publicly available, for which all the cloning steps are described to target a gene of interest. The control of Cas9 activity has been performed using an adaptation of a previously described system called KamiCas9, in which the transduction of the cells with a lentivirus encoding a guide RNA targeting the Cas9 allows the progressive abolition of Cas9 expression. This protocol has been applied to the development of a RYR1-knock out human muscle cell line, which has been further characterized at the protein and functional level, to confirm the knockout of this important calcium channel involved in muscle intracellular calcium release and in excitation-contraction coupling. The procedure described here can easily be applied to other genes in muscle cells or in other difficult to transfect cells and produce valuable tools to study these genes in human cells.

The protocol describes how to generate knock-out myoblasts using CRISPR/Cas9, starting from the design of guide-RNAs to the cellular cloning and characterization of the knock-out clones.

Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Genetica

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding disease that lacks effective treatment. We hypothesize that the cytotoxicity of the misfolded rhodopsin mutant can be alleviated by pharmacologically stabilizing the mutant rhodopsin protein. The P23H mutation, among the other Class II rhodopsin mutations, encodes a structurally unstable rhodopsin mutant protein that is accumulated in the endoplasmic reticulum (ER), whereas the wild type rhodopsin is transported to the plasma membrane in mammalian cells. We previously performed a luminescence-based high-throughput screen (HTS) and identified a group of pharmacological chaperones that rescued the transport of the P23H rhodopsin from ER to the plasma membrane. Here, using an immunostaining method followed by a high-content imaging analysis, we quantified the mutant rhodopsin protein amount in the whole cell and on the plasma membrane. This method is informative and effective to identify true hits from false positives following HTS. Additionally, the high-content image analysis enabled us to quantify multiple parameters from a single experiment to evaluate the pharmacological properties of each compound. Using this assay, we analyzed the effect of 11 different compounds towards six RP associated rhodopsin mutants, obtaining a 2-D pharmacological profile for a quantitative and qualitative understanding about the structural stability of these rhodopsin mutants and efficacy of different compounds towards these mutants.

Here, we described a high-content imaging method to quantify the transport of rhodopsin mutants associated with retinitis pigmentosa. A multiple-wavelength scoring analysis was used to quantify rhodopsin protein on the cell surface or in the whole cell.

Un saggio di trasporto Rhodopsin dall'analisi di Imaging ad alto contenuto

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Chimica

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Biologia

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between these features may be interrogated by controlling the phase transition of a disease-associated protein in a vulnerable cell type, although this experimental approach has been limited so far. Here, we describe a protocol to induce phase transition of the RNA/DNA-binding protein TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae for modeling cytoplasmic aggregation of TDP-43 occurring in degenerating motor neurons in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). We describe a bacterial artificial chromosome (BAC)-based genetic method to deliver an optogenetic TDP-43 variant selectively to spinal motor neurons of zebrafish. The high translucency of zebrafish larvae allows for the phase transition of the optogenetic TDP-43 in the spinal motor neurons by a simple external illumination using a light-emitting diode (LED) against unrestrained fish. We also present a basic workflow of live imaging of the zebrafish spinal motor neurons and image analysis with freely available Fiji/ImageJ software to characterize responses of the optogenetic TDP-43 to the light illumination. This protocol enables the characterization of TDP-43 phase transition and aggregate formation in an ALS-vulnerable cellular environment, which should facilitate an investigation of its cellular and behavioral consequences.

We describe a protocol to induce phase transition of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) by light in the spinal motor neurons using zebrafish as a model.

Transizione di fase optogenetica di TDP-43 nei motoneuroni spinali delle larve di zebrafish

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Neuroscienze

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Medicina

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes following physical activity, stress, or catecholamine challenge, which can deteriorate into potentially fatal ventricular fibrillation. The mouse heart is a widespread species for modeling inherited cardiac arrhythmic diseases, including CPVT. Simultaneous optical mapping of transmembrane potential (Vm) and calcium transients (CaT) from Langendorff-perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying arrhythmogenesis. Compared with the cellular level investigation, the optical mapping technique can test some electrophysiological parameters, such as the determination of activation, conduction velocity, action potential duration, and CaT duration. This paper presents the instrumentation setup and experimental procedure for high-throughput optical mapping of CaT and Vm in murine wild-type and heterozygous RyR2-R2474S/+ hearts, combined with programmed electrical pacing before and during the isoproterenol challenge. This approach has demonstrated a feasible and reliable method for mechanistically studying CPVT disease in an ex vivo mouse heart preparation.

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

This protocol introduces dual-dye optical mapping of mouse hearts obtained from wild-type and knock-in animals affected by catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, including electrophysiological measurements of transmembrane voltage and intracellular Ca2+ transients with high temporal and spatial resolution.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Approcci genetici e biochimici per

Riepilogo

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