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Tutti gli esperimenti sugli animali vengono eseguiti in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali dell&#39;Università di Toledo. 1. Fenotipizzazione di pIL1-DsRed Mice NOTA: Offspring sono generati da allevamento topi pIL1-DsRed eterozigoti con topi wild-type (WT) C57BL6. Da tre a quattro settimane di età cuccioli sono considerati pronti per fenotipizzazione. Sanguinamento sottomandibolare di topi segue un protocollo stabilito con piccole modifiche 23. <ol><li> Isolamento dei globuli bianchi dal sangue intero di mouse Pups <ol><li> Aggiungere 20 ml di eparina a ciascuna provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Acquisire un cucciolo dalla gabbia. Registrare il tag di identificazione del cucciolo. Non è necessario per anestetizzare i cuccioli prima raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare. </li><li> Tenere cucciolo dal collo collottola e perforare la vena sottomandibolare in thsacchetto guancia e con una lancetta 5 mm. Applicare la forza sufficiente per creare una piccola puntura, in modo che gocce di sangue trasudano dal punto di penetrazione. Usare un ago nuovo per ogni cucciolo. </li><li> Raccogliere 3 - 5 gocce di sangue per cuccioli in una provetta contenente eparina. Pulire il sito di puntura e applicare una pressione per facilitare l&#39;emostasi. </li><li> Mettere cucciolo in nuova gabbia e osservare per 30 minuti prima di tornare alla gabbia alla struttura degli animali. </li><li> Raccogliere il sangue da topi adulti di un fenotipo noto come controlli positivi e negativi. </li><li> Aggiungere 500 ml di tampone di lisi dei globuli rossi ad ogni provetta, tubi vortex, e incubare per 5 - 10 minuti in ghiaccio. </li><li> Aggiungere lentamente 400 - 500 ml di siero fetale bovino (FBS) sotto le sospensioni di cellule in ogni tubo. Un&#39;interfaccia chiara può essere osservata tra la sospensione cellulare di livello superiore e quella inferiore strato di FBS. </li><li> tubi tappo e centrifugare i campioni a 1500 g per 5 min. </li><li> Ripetere i punti 1.1.7 - 1.1.9 alla pellicciather rimuovere i globuli rossi. Non ripetere se lisi è sufficiente la prima volta. Il pellet dovrebbe essere difficile discernere dopo centrifugazione. </li></ol></li><li> Lipopolisaccaride (LPS) Stimolazione e cultura <ol><li> Risospendere le cellule in 200 ml di completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad un tubo di citometria a flusso. </li><li> Fare LPS soluzione di lavoro mescolando 10 ml di soluzione madre LPS (1 mg / ml) con 990 ml di completo RPMI 1640 medium. </li><li> Aggiungere 20 ml di 10 mg / LPS ml di soluzione di lavoro per 200 ml di sospensione cellulare. </li><li> Tubi Cap liberamente e incubare campioni per 4 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Flusso Analisi Citometria <ol><li> Aprire il programma di acquisizione dati per la citometria a flusso. Impostare template di acquisizione prima di assaggiare acquisizione. </li><li> Fare clic sullo strumento Dot-Plot nella palette degli strumenti. Disegnare un foscatter rward (FSC) vs lato scatter plot (SSC). Impostare i parametri di tensione FSC e SSC a scala lineare. </li><li> Selezionare i valori limite più bassi di FSC e SSC consentite dal citometro. Applicare le soglie di 200 e 50 per FSC e SSC, rispettivamente. </li><li> All&#39;interno del FSC vs SSC plot, disegnare un G1 cancello che comprende monociti, granulociti e cellule dendritiche, ed esclude detriti, globuli rossi e linfociti. </li><li> Fare clic sullo strumento Istogramma nella palette degli strumenti. Disegnare un istogramma FL2 (canale fluorescenza rossa). Utilizzare un campione di controllo negativo per impostare la linea di base dei segnali FL2 e un campione di controllo positivo per disegnare una porta per includere tutti gli eventi positivi DsRed. </li><li> Sul pannello Fluidics controllo del citometro, impostare la modalità fluido &quot;RUN&quot; e la portata di &quot;HI&quot; (circa 60 microlitri / min). Acquisire 10.000 eventi per ciascun campione. </li><li> Determinare pup fenotipo misurando la percentuale di cellule positive DsRed dalla porta G1. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. L&#39;induzione di infiammazione della pelle in pIL1-DsRed Mice <ol><li> Anestetizzare mouse intraperitoneale (ip) iniezione di un cocktail anestetico contenente 100 mg / kg ketamina, 10 mg / kg xylazina, e 1 mg / kg acepromazine. topi anestetizzati adeguatamente non mostrano posteriore ritiro zampa a pizzico punta. </li><li> Applicare la crema depilazione alla superficie dorsale di entrambe le orecchie del mouse. Attendere 30 sec a 1 min. Pulire la superficie orecchio con cotone bagnato di acqua e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Misurare lo spessore orecchio con micrometro e sostituire il mouse in una gabbia separata. Osservare fino al recupero dall&#39;anestesia (~ 15 - 30 min). Per risolvere infiammazione cutanea indotta dal prodotto epilazione, permettono mouse per riposare per 3 giorni prima di ulteriori sperimentazioni viene effettuata. </li><li> Preparare 1,25% (w / v) OX sciogliendo 16,7 mg di OX in 1 ml di acetone e mescolando 750 ml di soluzione / acetone OX con 250 ml di olio di oliva. Preparare la soluzione veicolo mescolando 750 ml di acetone con 250 &amp;# 181; l di olio d&#39;oliva. </li><li> Re-anestetizzare il mouse mediante iniezione ip di cocktail anestetico (2.1). Misurare lo spessore dell&#39;orecchio come prima. </li><li> Applicare 12,5 ml di 1,25% OX su ciascun lato dell&#39;orecchio destro. Applicare 12,5 ml di acetone / oliva soluzione veicolo olio su ciascun lato del orecchio sinistro. </li><li> Tenere il mouse separato dalla gabbia compagni fino alla completa guarigione per evitare insulto alle sue orecchie da altri topi, quindi sostituire il mouse nella sua gabbia originale e tornare alla struttura alloggiativa degli animali. NOTA: la rimozione dei capelli può provocare l&#39;infiammazione della pelle minore seguito dal cambiamento di spessore dell&#39;orecchio. Questa infiammazione minore sarà risolta 3 giorni più tardi confermata da spessore orecchio normale. Dopo l&#39;applicazione topica per 24 ore, le orecchie OX-trattati mostrano una significativa (p &lt;0.01) gonfiore soluzione veicolo rispetto orecchie solo trattati. </li></ol> 3. Etichettatura dei neutrofili in pIL1-DsRed Mice NOTA: In etichettatura vivo di neutrofili da una bassa dose di fluorescence-coniugato specifico per neutrofili mAb segue un protocollo sviluppato di recente 19. Iniezioni di retro-orbitale vengono eseguiti secondo un protocollo stabilito con alcune modifiche 24. <ol><li> Preparare la soluzione di lavoro anti-Ly6G mAb diluendo 10 ml di 0,5 mg / ml Alexa Fluor 647 coniugato anti-Ly6G monoclonale (clone 1A8) in 90 ml di tampone fosfato (PBS). </li><li> Trasferire 100 ml di soluzione di lavoro anti-Ly6G monoclonale (50 mg / ml) in un U-100 di insulina siringa con l&#39;ago calibro 28. </li><li> Anestetizzare un adulto pIL1-DsRed topo mediante iniezione ip del cocktail anestetico descritto in precedenza (2.1). Posizionare l&#39;addome del mouse anestetizzato giù su una tavola di lavoro pulito. </li><li> Applicare leggera pressione verso il basso dorsale pelle e ventrale un occhio mouse per sporgere parzialmente bulbo oculare dalla presa. </li><li> posizionare accuratamente l&#39;ago, smussare giù, con un angolo di circa 30 ° al canto mediale nel retro-orbitaleseno. NOTA: L&#39;operatore può sentire la pressione, la penetrazione e resistenza sollevato una volta gli inserti ago nel seno. </li><li> Lentamente e senza intoppi iniettare 100 ml di anti-Ly6G mAb soluzione (5 mg mAb / mouse / iniezione) nel mouse di lavoro. Rimuovere rapidamente l&#39;ago. Una piccola quantità di sanguinamento suggerisce una iniezione di successo. </li><li> Applicare immediatamente 1,25% OX e la soluzione veicolo sul orecchio sinistro destro del mouse e. </li><li> Dopo 8 ore, somministrare 100 ml di soluzione preparata di recente anti-Ly6G monoclonale di lavoro (5 mcg mAb / mouse / iniezione) tramite iniezione retro-orbitale nello stesso mouse. </li><li> Per visualizzare i vasi sanguigni, immediatamente prima di imaging, somministrare 100 ml di 30 mg / ml di fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata destrano (150 kDa) mediante iniezione retro-orbitale. </li></ol> 4. Imaging intravitale di neutrofili adescamento in Pil-1-DsRed Mice <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezione ip di cocktail anestetico (2.1).0; Applicare una pomata veterinario per gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia per l&#39;imaging. <ol><li> Preparare 1 ml metà dose cocktail anestetico diluendo 500 ml di cocktail anestetico originale con un volume uguale di PBS. </li><li> Trasferimento mezza dose cocktail anestetico per 1 ml siringa con un ago calibro 27 farfalla. </li><li> Inserire l&#39;ago della farfalla in addome del mouse per via intraperitoneale e fissare l&#39;ala farfalla per l&#39;addome con nastro adesivo. </li></ol></li><li> Collocare un vetrino di vetro al centro del palcoscenico imaging. Nastro i bordi del vetrino per tenerlo in posizione. </li><li> Mettere una goccia di PBS sulla superficie ventrale dell&#39;orecchio del mouse nonché sul vetrino. </li><li> Posizione anestetizzato del mouse con il suo orecchio sopra il vetrino. Montare la punta di un orecchio, lato dorsale verso il basso, dal sandwiching l&#39;orecchio tra il vetrino e un vetrino, tenuto anche in luogo tramite nastro. </li><li> Accendere un multi-laser confocale microscopio a fluorescenza e tutta la relativa equipment. Spegnere luci della stanza per minimizzare l&#39;esposizione della luce ambiente. </li><li> Aprire il software di acquisizione immagini. Selezionare i canali laser per la rilevazione di coloranti fluorescenti nel menu Dye List. </li><li> Regolare il fuoco sulla pelle infiammata orecchio per l&#39;osservazione dei segnali verdi dai vasi sanguigni e segnali rossi delle cellule + DsRed attraverso oculare. </li><li> Eseguire una scansione veloce con velocità di scansione di 2 ms / pixel e una risoluzione di 512 × 512 pixel. Selezionare un pseudocolori per ogni canale nel menu Live View. Regolare la manopola di messa a fuoco per impostare la fine e iniziare posizione di scansione. </li><li> Eseguire scansioni lente con velocità di scansione di 4-8 msec / pixel e risoluzione di 800 × 800 o 1.024 × 1.024 pixel. Regolare l&#39;alta tensione, guadagno e offset su ciascun canale per massimizzare l&#39;intensità dei segnali evitando saturazione (pixel rossi). Ci dovrebbe essere solo pochi pixel rossi in ogni canale. </li><li> Creare set di immagini tridimensionali mediante la scansione di thla pelle e l&#39;orecchio a partire superficialmente nello strato corneo e procedendo verso il basso con x, y, z volumi di 317 micron × 317 micron × 30 micron (obiettivo 40X), 635 micron × 635 micron × 30 micron (obiettivo 20X), o 1.270 micron × 1.270 micron × 50 micron (obiettivo 10X) a 2 micron z-passi. NOTA: Lo strato corneo è lo strato più esterno dell&#39;epidermide e può essere facilmente localizzati sulla forte segnale di autofluorescenza. </li><li> In esperimenti di imaging time-lapse, registrare le immagini tridimensionali ogni 2 o 4 min per un massimo di 8 ore. </li><li> A intermittenza, come il mouse comincia a recuperare dall&#39;anestesia, ha osservato basata sull&#39;osservazione di baffi spasmi, somministrare 5 - 10 ml di mezza dose di anestesia cocktail con ago a farfalla. NOTA: Siate prudenti della dose di anestesia - sovradosaggio può causare la morte del mouse. In alternativa, anestesia per inalazione in un vaso potrebbe essere applicato al mouse per anestesia breve termine econo potrebbe essere utilizzata per l&#39;imaging a lungo termine. </li><li> Rimuovere il mouse anestetizzato dalla fase in cui l&#39;imaging è completa. Staccare il nastro e rimuovere ago a farfalla dal ventre del mouse. Ritorna il mouse in una gabbia separata nella struttura stabulazione degli animali. NOTA: Per l&#39;imaging a breve termine (&lt;1 ora), i topi riprendersi completamente dall&#39;anestesia rapidamente in 1-3 ore. Per l&#39;imaging a lungo termine (~ 8 ore), i topi recuperare lentamente, con un tipico periodo di recupero di 12 - 16 ore. Così, la somministrazione orale di acqua è raccomandato almeno diverse volte durante il periodo di recupero per evitare una grave disidratazione. </li><li> Processo set di dati di imaging, monitorare le singole cellule, generare percorsi migratori, e calcolare la direzionalità e la velocità di migrazione delle cellule utilizzando immagine software di analisi 25. </li></ol>

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	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+innate+immune+response.">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li><li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming:+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms.">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li><li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation:+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane.">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li><li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases.">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li><li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues.">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li><li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immunoimaging--deeper,+bigger,+more+precise,+and+definitively+more+colorful.">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li><li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+biology+in+live+animals:+ready+for+prime+time.">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li><li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events.">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF.">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection.">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression.">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li><li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice.">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li><li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines.">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin.">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo.">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li><li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils.">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li><li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation.">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation.">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice).">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration).">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li><li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening.">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li><li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+proteins:+selling+cytokines+by+the+pound.">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li><li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes.">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production,+survival,+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation.">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una tecnologia per il monitoraggio del processo di neutrofili adescamento in animali viventi, che non è stata ancora soddisfatte dalle tecniche attualmente disponibili. Per raggiungere questo obiettivo, tre metodologie consolidate vengono eseguiti: 1) induzione di infiammazione della pelle in topi reporter DsRed promotore-driven IL-1b come misura di priming, 2) in vivo etichettatura dei neutrofili con basse dosi di fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb, e 3) con...

I neutrofili sono i più abbondanti e di breve durata leucociti in circolazione. Essi stanno rapidamente reclutati per i siti di infezione o lesioni, dove servono fagociti come professionisti attraverso il rilascio di reattivi intermedi ossigeno e di azoto insieme con granuli contenenti peptidi antimicrobici e proteasi 1. Durante il loro reclutamento, i neutrofili sono &quot;innescato&quot; da vari agenti compresi i prodotti microbici, chemoattractants, e citochine infiammatorie, con conseguente funzionalità dei fagociti nettamente migliorata all&#39;arrivo in un sito di infiammazione 2. I meccanismi di priming neutrofili sono state ampiamente studiate in vitro 3,4; Tuttavia, il monitoraggio dinamico del processo in vivo non è stato possibile finora. Recentemente, l&#39;imaging intravitale è diventata una tecnica importante per la visualizzazione e quantificare le dinamiche cellulari di processi biologici degli organismi viventi. IntraviImaging tal può essere effettuato tramite convenzionale eccitazione microscopia one-photon (ad esempio, confocale) o multiphoton microscopia avvicina 5. Nel corso del tempo, sostanziali miglioramenti sono stati raggiunti in questa tecnica che consente una maggiore risoluzione delle immagini, una maggiore profondità delle immagini, riduzione fotodanneggiamento del tessuto, e una maggiore 6,7 stabilizzazione delle immagini. Data la sua capacità unica di consentire la visualizzazione dinamica di migrazione cellulare e l&#39;interazione con il tempo, la microscopia intravitale è stato ampiamente applicato a diverse aree di studio in immunologia 8. l&#39;imaging intravitale consente immunologi di comprendere e contestualizzare le risposte immunitarie, sia a livello cellulare e molecolare in modelli animali vivere meglio. I recenti progressi nella transgenici e knock-in topi reporter hanno fornito strumenti utili per il monitoraggio dei comportamenti dinamici di neutrofili negli animali viventi. Il lisozima M promotore-driven maggiore proteina fluorescente verde knock-ini topi sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare la motilità dei neutrofili, monociti e macrofagi durante i vari processi infiammatori tra cui stravaso, infezione batterica, e l&#39;infiammazione sterile 9-15. Inoltre, i topi transgenici che esprimono una fluorescenza di risonanza di trasferimento di energia biosensore citoplasmatica sono stati impiegati nello studio delle attività di neutrofili mitogeno chinasi extracellulare-regolamentato e la proteina chinasi A all&#39;interno dell&#39;intestino infiammato 16. Un modello murino con alta specificità per l&#39;espressione di fluorescenza nei neutrofili è il mouse Catchup knock-in, che produce Cre ricombinasi, nonche la tdTomato proteina fluorescente, che si è accoppiata espressione di linfociti antigene 6G (Ly6G) 17. Visualizzazione dei neutrofili Ly6G-deficienti attraverso questo modello ha dimostrato che queste cellule esercitano funzionalità normale in una varietà di contesti infiammatori vivo sterili o infettive. topi transgenici che esprimono la DsRed fluorescente protein gene sotto il controllo del mouse interleuikin-1β (IL-1β) promotore (pIL1-DsRed) sono stati utilizzati per visualizzare i comportamenti motilità delle cellule che producono IL-1b - ritenuto includere neutrofili, monociti infiammatori e macrofagi attivati ​​- emergente in pelle infiammata 18. In vivo etichettatura può servire come un approccio alternativo per tracciare i comportamenti cellulari e molecolari di neutrofili nei tessuti infiammati. Dopo l&#39;iniezione endovenosa di basse dosi di fluorescente anti- Gr-1-anticorpo monoclonale (mAb), la cascata reclutamento di Gr-1 + neutrofili è stata visualizzata in lesioni cutanee topo con infezioni da Staphylococcus aureus 19. Somministrazione in vivo di coniugati contenenti streptavidina coniugati 705 nm punti quantici e biotinilato anti-Ly6G mAb etichetta specificamente neutrofili circolanti 20. Inoltre, endocitosi di tali coniugati in neutrophIL vescicole permette il monitoraggio del trasporto delle vescicole ad alta velocità nei neutrofili migrano nell&#39;interstizio. In vivo etichettatura con anticorpi fluorescenza coniugato contro P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e chemochine (CXC motivo) recettore 2 (CXCR2) in un modello infiammatoria TNF-indotta ha chiarito i meccanismi di regolazione in gioco durante l&#39;infiammazione precoce 21. neutrofili polarizzati sporgono uropodi PSGL-1-arricchito di interagire con CD62L presenti sulle piastrine attivate, con la conseguente ridistribuzione di CD11b e CXCR2, recettori che guidano la migrazione dei neutrofili e avviano l&#39;infiammazione. IL-1β è uno dei geni di firma che è elevata in neutrofili innescato 22. In topi reporter pIL1-DsRed, segnali di fluorescenza DsRed (es., L&#39;attivazione del promotore di IL-1β) correlano positivamente con IL-1β mRNA espressione e la produzione di proteine ​​di IL-1β. &lt;sup&gt; 18 per monitorare il processo di neutrofili adescamento, un metodo di microscopia intravitale è stato sviluppato coinvolgendo l&#39;induzione di infiammazione della pelle con oxazolone (OX) nel modello murino pIL1-DsRed seguente etichettatura in vivo dei neutrofili con fluorescenza coniugato anti-Ly6G mAb. Attraverso questo modello, è possibile studiare il comportamento e la funzione dei neutrofili innescato in modelli animali di varie malattie e disturbi.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Hair-removal cream</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulin syringe with 28 G needle</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infusion set (27 G needle)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti in circolazione del sangue umano e sono rapidamente reclutati ai siti infiammatori. L&#39;adescamento è un evento critico che aumenta la funzionalità fagocitaria dei neutrofili. Sebbene studi approfonditi hanno svelato l&#39;esistenza e l&#39;importanza di neutrofili adescamento durante l&#39;infezione e lesioni, i mezzi di visualizzare questo processo in vivo sono stati disponibili. Il protocollo fornito consente il monitoraggio del processo dinamico di neutrofili adescamento in animali viventi combinando tre metodologie: 1) Segnale giornalista DsRed - usato come misura di adescamento 2) in vivo etichettatura neutrofili - ottenuto mediante iniezione di fluorescenza coniugato antigene anti-linfociti 6G (Ly6G) anticorpo monoclonale (mAb) e 3) confocale intravitale. Diversi passaggi critici sono coinvolti in questo protocollo: Mouse infiammazione oxazolone indotta pelle orecchio, adeguata sedazione degli animali, ripetute iniezioni di anti-Ly6G mAb, e prevenzione fuoco deriva durante l&#39;imaging. Sebbene alcune limitazioni sono stati osservati, come il limite di tempo di imaging continuo (~ 8 ore) in un mouse e la fuoriuscita di fluorescina isotiocianato-destrano dai vasi sanguigni in stato infiammatorio, questo protocollo fornisce un quadro fondamentale per l&#39;imaging intravitale di comportamento innescato neutrofili e la funzione, che può essere facilmente ampliato per l&#39;esame di altre cellule del sistema immunitario in modelli murini di infiammazione.

Proiezione di topi pIL1-DsRed è effettuata sulla base del segnale di fluorescenza fenotipica DsRed prodotto dai loro leucociti del sangue periferico mediante citometria a flusso. Stimolazione LPS è nota per indurre la produzione di IL-1β in cellule mieloidi, tra cui i neutrofili, monociti e cellule dendritiche 26-28. Così, leucociti isolati vengono incubate con LPS per 4 ore prima di citometria a flusso di analisi. Avanti, gating è fissato per viene misurata in questa pop...

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Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

Video: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio a lungo termine delle risposte infiammatorie

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. Neutrophils can be recruited to inflammation sites via the guidance of cytokines and chemokines. Overwhelming infiltration of neutrophils can lead to indiscriminate tissue damage, such as in rheumatoid arthritis (RA). Neutrophils isolated from peritoneal exudate respond to a defined chemoattractant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro in Transwell or Zigmond chamber assays. The air pouch experiment can be used to evaluate the chemotaxis of neutrophils towards lipopolysaccharide (LPS) in vivo. The adjuvant-induced arthritis (AA) mouse model is frequently used in RA research, and immunohistochemical staining of joint sections with anti-myeloperoxidase (MPO) or anti-neutrophil elastase (NE) antibodies is a well-established method to measure neutrophil infiltration. These methods can be used to discover promising therapies targeting neutrophil migration.

Here, we present three methods to assess neutrophil migration and infiltration both in vivo and in vitro. These methods can be used to discover promising therapeutics targeting neutrophil migration.

Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione dei neutrofili nei topi

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

Biologia

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

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Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo