C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

Tutte le procedure che utilizzano soggetti animali sono stati in conformità con gli standard dell&#39;Istituto di cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) alla Western Michigan University. 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare i ratti maschi e femmine 3 mesi di età in questo studio. </li><li> Mantenere gli animali in un ciclo di 12 ore luce / buio con libero accesso a cibo e acqua. </li></ol> 2. Preparazione di KAX Cocktail per anestesia degli animali <ol><li> Sciogliere 50 mg di xilazina (20 mg / ml) in 5 ml di ketamina (100 mg / ml) con 1 ml acepromazine (10 mg / ml) e 3 ml di acqua distillata. Mescolare accuratamente. </li><li> Sterilizzazione con un filtro a siringa e conservare questa soluzione in un flacone di siero 10 ml. </li></ol> 3. KAX Iniezione <ol><li> Pesare animale (g) e ritornare alla gabbia fino pronta per l&#39;iniezione. </li><li> Iniettare 0,1 ml KAX / 100 g di peso corporeo degli animali per via intraperitoneale, utilizzando una siringa da insulina da 1 ml con un ago 28 G. </li><li> consentireper animali a perdere conoscenza. Controllare riflessi pizzicare i piedi e la coda. </li><li> Mantenere tutti gli animali in modo sicuro in laboratorio per la durata dell&#39;intervento. </li><li> Post-operatorio, sostituire gli animali nelle loro gabbie e mantenere confortevole a RT finché non viene ripreso conoscenza. Solo tornare animali per l&#39;impianto degli animali quando gli animali si svegliano e riprendere un comportamento normale. </li></ol> 4. preparazione per la chirurgia e montaggio Microneedle <ol><li> Fare uno sterile 2 soluzione M NaCl. </li><li> Utilizzare un estrattore microelettrodo (Figura 1C) per tirare uno 0,86 millimetri di diametro interno pesante standard di lucido e tubo borosilicato a parete sottile in due microaghi di vetro finemente conici (Figura 1D, 1E Figura). </li><li> Backfill un microago dal passaggio precedente con 2 M soluzione salina con un ago riempimento siringa e una siringa da 1 ml (Figura 1B). Toccare le bolle d&#39;aria dalla punta dell&#39;elettrodo. </li><li> Riempire una seconda siringa da 1 ml con 2 MNaCl. Collegare un ago G 18 e quindi collegare una lunghezza (circa 10 pollici) di tubo in polietilene (Figura 1A). Utilizzare lo stantuffo della siringa per riempire il tubo di polietilene con soluzione fisiologica attraverso l&#39;ago. </li><li> Quando sia il microago e tubetti sono riempite con soluzione salina, collegare accuratamente i due. Eliminare eventuale aria nella connessione tra loro (figura 2). </li><li> Finemente smussare la punta del microago raschiandola molto leggermente contro il grano di un tovagliolo di carta corso. </li><li> Controllare la resistenza del microago spingendo delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando un bel flusso di liquido può essere visto sul tovagliolo di carta. Il flusso di liquido deve essere più largo 0,5 mm. </li></ol> 5. Preparazione di Animal <ol><li> Applicare 1 - 2 gocce di anestetico topico per cornea (proparacaina cloridrato soluzione oftalmica, USP, 0,5%). Attendere fino a quando non si verifica alcun riflesso oculare. </li><li> Trim baffi con le forbici. </li><li> Saturate un cotton-fioc con la soluzione betadine e zona tampone intorno all&#39;occhio sperimentale. </li><li> Utilizzando un microscopio, allegare un emostatico per bloccare la palpebra inferiore a gonfiarsi l&#39;occhio, esporre la vena episclerale e limitare il movimento degli occhi. (Figura 3, punta di freccia) </li></ol> 6. Saline iniezione glaucoma che inducono <ol><li> Quando l&#39;assemblea microneedle e l&#39;animale sono preparati, iniziare le iniezioni. </li><li> Quando l&#39;animale si conferma essere insensibile a piedi / coda pizzico, perforare con attenzione la vena episclerale con il microago, venendo ad un angolo basso tra i 10 ei 20 gradi alla vena (Figura 3, freccia bianca). Una puntura successo nella vena è evidente quando il sangue entra nella punta del microago (Figura 3, freccia nera). </li><li> Lentamente e manualmente iniettare circa 50 microlitri di soluzione salina nella vena. Questo dovrebbe prendere circa 10 sec. Le vene saranno sbollentare bianca come il sale circola through del sistema vascolare (figura 4, punta di freccia). Alcune regioni possono mantenere un aspetto rosso sangue (figura 4, freccia). <ol><li> Eseguire una seconda iniezione nella vena, opposto al sito del primo, per garantire completa danno retinico allo strato completo di cellule gangliari retiniche. Nota: In pochi minuti, si dovrebbe vedere un aspetto torbido distinta attraverso l&#39;iride dell&#39;occhio come sali circola attraverso il sistema vascolare. </li></ol></li><li> Lasciare l&#39;occhio opposto greggia per uso come controllo interno. </li></ol> 7. il recupero degli animali <ol><li> Rimuovere la pinza emostatica. </li><li> Utilizzare un applicatore di cotone per applicare tripla pomata antibiotica (Bacitracin di zinco, solfato di neomicina, polymysin B solfato) al sito bloccato dalla pinza emostatica e ai siti di iniezione. Il danno tissutale intorno all&#39;occhio non si verifica utilizzando la pinza emostatica. </li><li> &gt; Luogo anestetizzato animali nelle loro gabbie su un circolante coperta di acqua calda per previpotermia ent. Mantenere gli animali sotto osservazione fino a quando la coscienza e il comportamento normale sono riacquistato. Trasportare animali svegli di nuovo alla colonia degli animali. Animali rimangono nella colonia fino al momento del sacrificio. </li></ol> 8. sacrificio animale e rimozione Retina <ol><li> Un mese dopo la procedura per indurre il glaucoma, gli animali sono eutanasia da CO 2 asfissia e la puntura toracica secondaria. <ol><li> Posto l&#39;animale nella camera e mettere il coperchio saldamente. </li><li> Aprire le valvole di CO 2 e regolatore del gas per permettere al 20% del volume / min CO 2 spostamento ossigeno nella camera. </li><li> Lasciare quattro a 5 minuti per l&#39;animale a scadenza. </li><li> Spegnere entrambe le valvole. </li><li> Rimuovere animale dalla camera ed eseguire una puntura toracico secondario con un bisturi sterile. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;eutanasia, usare un bisturi per tagliare il tessuto connettivo nella cavità orbitale che circonda l&#39;occhio, being attenzione a non tagliare nel bulbo oculare stesso. </li><li> usare cautela forbici bordo curvo per tagliare il nervo ottico e qualsiasi tessuto rimanente per estrarre il bulbo oculare intatta. Mettere bulbo oculare estratto in una sterile 60 millimetri x 15 mm piastra di Petri monouso contenente PBS fresco. </li><li> Fare un oculare dal bulbo oculare. Per fare questo, fare una piccola incisione con il bisturi appena posteriore al confine tra l&#39;iride e la sclera. Seguire questa incisione intorno alla circonferenza dell&#39;occhio con piccole forbici a molla per rimuovere dell&#39;emisfero corneale dal bulbo oculare. L&#39;emisfero collegato al nervo ottico rimane. </li><li> Trova la retina molto sottile di colore rosa / beige all&#39;interno della conchiglia oculare dall&#39;animale eutanasia. Tenere lo strato pigmentato della retina con una pinza smussati per stabilizzare il paraocchi. Utilizzare un altro paio di pinze chiuse per prendere in giro molto delicatamente tutta la retina intatto al largo della parte posteriore dell&#39;occhio. Evitare di pizzicare, tirare, o tirando direttamente la retina. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la primaveraarea in cui il nervo ottico è ancora attaccato alla retina. </li><li> Assicuratevi di tagliare via ogni residuo di epitelio pigmentato o tessuto sclerale dalla retina. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, trasferire molto delicatamente la retina isolata ad un Sylgard pulito rivestito 35 millimetri x 10 mm piastra di Petri contenente PBS fresco. </li></ol> 9. tutto il montaggio Retina Preparazione <ol><li> Una volta nel piatto Sylgard, usare una pinza e un ago cactus al pin della retina in posizione. Mantenere lo strato di cellule gangliari della retina rivolto verso l&#39;alto e verso il basso del nervo ottico. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Utilizzare piccole forbici per tagliare la retina in quattro quadranti, rendendo la forma di un quadrifoglio irradia dalla testa del nervo ottico. </li><li> Pin i quadranti della retina con aghi di cactus aggiuntive per rendere la retina più piatta possibile without allungamento (Figura 5). </li><li> Fissare le retine riposte nel piatto Sylgard con 3 ml di paraformaldeide al 4% O / N a temperatura ambiente. </li></ol> 10. Anticorpo colorazione di Retina Nota: retine Stain fissi con anticorpi primari e secondari per la visualizzazione neuroni della retina (Figura 6). <ol><li> Risciacquare, retine piatto montato fisso tre volte per 2 minuti ciascuno in PBS. </li><li> Permeabilize le retine con 1% Triton X-100 con 1% di siero fetale bovino in PBS per 60 min. </li><li> Sciacquare retine per tre volte, 2 min ciascuna, in PBS. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare con 1% Triton X-100 e 1% di siero bovino fetale in PBS a temperatura ambiente per 45 min. </li><li> Risciacquare due volte con 0,1% Triton X-100 in PBS, 5 min a lavaggio. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml 1% di siero fetale bovino in PBScon il mouse purificato anti-topo CD90 / mouse CD90.1 (1: 300 diluizione) O / N a RT. </li><li> Risciacquare retine volta con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min. </li><li> Sciacquare due volte con PBS, 5 minuti a lavaggio. </li><li> Incubare ciascuna retina in 3 ml di PBS (senza FBS) con secondario Alexa Fluor 594 capra anti-IgG di topo (1: 300) O / N a RT. </li><li> Lavare retine con PBS liberamente. </li><li> Utilizzando un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione gli aghi di cactus dalla retina. </li><li> trasferire delicatamente retine su vetrini da microscopio con una pipetta di trasferimento. Assicurarsi di mantenere l&#39;orientamento con strato di cellule gangliari della retina di fronte al soffitto. forma emisferica della retina è notevole, anche dopo la fissazione. La curvatura della retina si arricciano verso il soffitto quando lo strato di cellule gangliari retiniche è nell&#39;orientamento desiderato. </li><li> Assorbire ogni eccesso di PBS con KimWipe o altro materiale assorbente. Fare attenzione a non assorbire la retina. </li><li> Aggiungere 5 gocce di ½ glicerolo e ½ PBS in peso per la mattinamezzi ontaggio. </li><li> Coprire retina con vetrino, evitando bolle d&#39;aria. </li><li> coprioggetto protetta tramite smalto trasparente, colla o altro adesivo. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

Questo protocollo descrive un metodo per indurre condizioni glaucoma simile in un modello in vivo di ratto in. Questa procedura utilizza una iniezione di soluzione salina ipertonica per indurre cicatrici nel trabecolato 29, 32. Sviluppare tessuto cicatriziale occlude il deflusso dell&#39;umore acqueo che aumenta la pressione nella camera anteriore. Con diminuito deflusso e la pressione si accumulano, la lente sospesa da legamenti elastici spinge indietro nella camera vitrea. vitreo poi appli...

Il glaucoma è un gruppo di malattie oculari che colpiscono i neuroni nella retina, in particolare, le cellule gangliari retiniche 1-2. Gli assoni di queste cellule convergono per diventare il nervo ottico che trasportano informazioni visive al cervello in cui viene percepita la visione. Danni alle RGCs e le loro assoni provoca quindi difetti visivi. Le caratteristiche principali associati a disturbi glaucoma sono RGC degenerazione e la morte, aumento della pressione intraoculare (IOP), e coppettazione disco ottico e atrofia. Queste caratteristiche portano alla perdita del campo visivo o totale, la cecità irreversibile. Attualmente, il glaucoma ha causato la cecità in 70 milioni di persone in tutto il mondo 3. Come tale, essa è la terza causa mondiale di cecità 4. Il meccanismo esatto della morte RGC nel glaucoma rimane sconosciuto. Gran parte della ricerca è stato fatto per svelare il mistero. È noto, tuttavia, che il principale fattore di rischio di glaucoma è un aumento in pressione intraoculare dovuta alla circolazione irregolare di umore acqueo (AH) nella camera anteriore dell&#39;occhio. AH agisce come alternativa trasparente e incolore di sangue nella camera anteriore dell&#39;occhio avascolare. Si nutre le cellule circostanti, rimuove i residui secreti dai processi metabolici, trasporti neurotrasmettitori, e permette la circolazione di farmaci e cellule infiammatorie all&#39;interno dell&#39;occhio durante gli stati patologici 1. Il mantenimento della circolazione di umore acqueo coinvolge il corpo ciliare e trabecolato. umor acqueo è prodotto dal corpo ciliare. Esso fluisce poi nella camera anteriore per mantenere la salute generale del tessuto oculare. 75 - 80% del deflusso dell&#39;umor acqueo viene secreto attivamente attraverso la non-pigmentazione dell&#39;epitelio ciliare quando il fluido viene filtrato attraverso tre strati di tessuto spugnoso nel muscolo ciliare. Le uscite fluido attraverso il trabecolato e attraverso canale di Schlemm che empti nel sistema sanguigno 5 .Il restante 20 - 25% del deflusso bypassa trabecolare che è passivamente secreti da ultrafiltrazione e diffusione attraverso la via uveo-sclerale. Questo percorso sembra essere relativamente indipendente dalla pressione intraoculare 1. Quando la produzione umore acqueo e deflusso sono in equilibrio, la pressione aumenta all&#39;interno dell&#39;occhio. Come detto, questo aumento della pressione intraoculare è il principale fattore di rischio per lo sviluppo di glaucoma. Tale pressione provoca danni agli strati intricate neuroni della retina nella parte posteriore dell&#39;occhio. Danni ai assoni delle cellule gangliari della retina del nervo ottico fa sì che il cervello a non ricevere più accurate informazioni visive. Come risultato, la percezione di visione è persa e può verificarsi completa cecità. Fino ad oggi, non esiste una cura per il glaucoma. Diversi metodi di trattamento esistenti che in primo luogo lo scopo di ridurre la pressione intraoculare. Questi includono attualitàclassi di farmaci come i bloccanti dei recettori beta1-adrenergici, o analoghi delle prostaglandine per uso topico. I beta-bloccanti riducono la pressione intraoculare riducendo la produzione di umore acqueo 7. Le prostaglandine funzione per ridurre la PIO aumentando il deflusso dell&#39;umore acqueo 8-14. Alfa agonisti adrenergici e inibitori dell&#39;anidrasi carbonica sono utilizzati anche come metodi secondari di trattamento. Alpha agonisti adrenergici aumentano deflusso attraverso la via uveosclerale 15-17. Inibitori dell&#39;anidrasi carbonica riducono la produzione di AH per inibizione enzimatica 18. Molto procedure più invasive vengono utilizzati anche per il trattamento del glaucoma. Trabeculoplastica laser è usato per aumentare il deflusso dell&#39;umore acqueo 19. Un&#39;altra terapia chirurgica, chiamata trabeculectomia, crea un sito di drenaggio alternativo per filtrare AH quando il percorso trabecolare tradizionale è bloccato 20-21. Queste opzioni di trattamento sono stati conosciuti per effettivamente ridurre la IOP. Tuttavia, fino al 40% dei pazienti affetti da glaucoma mostrano normali livelli di IOP suggerendo la necessità di metodi terapeutici più completi. 22,23 Inoltre, la morte delle cellule gangliari della retina visto nel glaucoma è irreversibile, una volta che inizia e trattamenti attuali non si fermano la progressione della malattia 24-28. Ciò ha evidenziato la necessità di efficaci terapie neuroprotettive che colpiscono la sopravvivenza dei neuroni stessi. Sviluppo di modelli glaucoma è fondamentale per questo sviluppo. In questo studio stiamo dimostrando un metodo di indurre effetti glaucoma simili nei ratti adulti lungo Evans utilizzando una procedura modificata originariamente delineato da Morrison 29. In questa procedura, iniezioni di 2 M soluzione salina ipertonica nel plesso venoso episclerale induce condizioni di glaucoma, come da cicatrici di tessuto per ridurre deflusso dell&#39;umore acqueo nel trabecolato che porta a un aumento della pressione intraoculare e una significativa perdita di RGCs wntro un mese dalla procedura di 30-31. procedure di glaucoma che inducono, come quella descritta qui, può essere la chiave per sbloccare nuovi sviluppi nel trattamento del glaucoma.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

Il glaucoma è una malattia del sistema nervoso centrale che colpisce le cellule gangliari retiniche (RGC). assoni RGC che costituiscono il nervo ottico portano input visivo al cervello per la percezione visiva. Danni alle RGCs e ai loro assoni porta alla perdita della vista e / o cecità. Anche se la causa specifica del glaucoma è sconosciuto, il fattore di rischio per la malattia è una pressione intraoculare. procedure di glaucoma che inducono in modelli animali sono uno strumento prezioso per i ricercatori che studiano il meccanismo della morte RGC. Tali informazioni possono portare allo sviluppo di trattamenti neuroprotettivi efficaci che potrebbero essere di aiuto nella prevenzione della perdita della vista. Il protocollo in questo documento descrive un metodo per indurre glaucoma - come condizioni in un modello di ratto in vivo dove 50 ml di 2 M salina ipertonica viene iniettato nel plesso venoso episclerale. Sbiancamento dei vasi indica iniezione di successo. Questa procedura provoca la perdita di RGCs per simulare il glaucoma. Un mese dopoiniezione, animali vengono sacrificati e gli occhi vengono rimossi. Successivamente, la cornea, lenti, e vitreo vengono rimossi per fare un oculare. La retina è poi sfogliato dalla parte posteriore dell&#39;occhio e appuntato su piatti Sylgard utilizzando aghi di cactus. A questo punto, i neuroni della retina possono essere colorati per l&#39;analisi. I risultati di questo laboratorio mostrano che circa il 25% dei RGCs sono persi entro un mese della procedura rispetto ai controlli interni. Questa procedura consente di analisi quantitativa di morte delle cellule gangliari della retina in un modello di topo di glaucoma in vivo.

Questa sezione illustra i componenti apparecchiature e procedure utilizzate per indurre condizioni di glaucoma, come in un topo modello di glaucoma in vivo. Mostriamo i singoli strumenti e delle attrezzature utilizzate per eseguire una iniezione salina ipertonica che provoca un aumento della pressione intraoculare. Mostriamo l&#39;iniezione nel plesso venoso episclerale con il suo effetto scottatura caratteristico e l&#39;aspetto torbido della camera anteriore risultante. Abbiam...

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K Views.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Metodi di imaging immunoistochimici e di calcio in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Ricerca

Neuroscienze

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Metodologia per la neuromodulazione Biomimetic chimico di retine del ratto con il neurotrasmettitore glutammato In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioingegneria

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

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The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

Il modello di roditore di nonarteritic Neuropatia ottica ischemica anteriore (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Valutazione dell'attività del calcio nello strato di cellule gangliari retiniche

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

Autore in primo piano: Un approccio innovativo alla stimolazione elettrica neurale utilizzando l'imaging del calcio 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Glaucoma inducono Procedura in un

Riepilogo

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Un magnetica microperla occlusione modello per indurre ipertensione oculare-Dependent Glaucoma nei topi

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Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Valutazione fisiopatologica retinica in un modello di ratto

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente

Imaging del calcio nelle retine piatte stimolate elettricamente