Gli autori ringraziano finanziamento da parte della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) in Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC Pacifico) contratto n N6601-13-C-2027. La pubblicazione di questo materiale non costituisce approvazione da parte del governo dei risultati o le conclusioni nel presente documento.

1. idrogel Bioink formulazioni e Preparazione <ol><li> Al fine di fornire profili biochimici tessuto-specifici, preparare tessuto-specifica ECM digerire soluzioni come descritto in precedenza per il fegato. 20 Nota: In generale, questo ECM digest comprenderà 40% del volume bioink idrogel finale che viene impiegato. Diverse centinaia di millilitri di soluzione ECM digest possono essere preparati, aliquotati e congelati a -80 ° C per un uso futuro. </li><li> Prima di idrogel formulazione, sciogliere un fotoiniziatore, 2-idrossi-4 &#39;- (2-idrossietossi) -2-methylpropiophenone, in acqua a 0,1% w / v. Nota: I volumi nel range 50-100 ml possono essere preparati in anticipo e conservati al riparo dalla luce a 4 ° C per diversi mesi. </li><li> Per formare bioinks idrogel, prima sciogliere i componenti del materiale base dalla acido ialuronico (HA) Kit idrogel nella soluzione acqua-fotoiniziatore. <ol><li> Sciogliere la gelatina tiolati HA e tiolati separatamente in acqua-psoluzione hotoinitiator (passo 1,2) per rendere il 2% w / v soluzioni. </li><li> Sciogliere polietilenglicole diacrilato (PEGDA), il reticolante nei kit idrogel, in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v. </li><li> Sciogliere polietilene glicole (PEG) 8-Braccio alchino (10 kDa MW) in soluzione acquosa-fotoiniziatore (passo 1.2) per rendere un 8% w / v. </li></ol></li><li> In generale, formare idrogeli utilizzando il seguente schema, anche se la personalizzazione supplementare è possibile. <ol><li> Unire 4 parti 2% tiolati HA, 4 parti 2% di gelatina tiolati, 1 parte reticolante 1, 1 parte di reticolante 2 con 8 parti soluzione tessuto ECM e 2 parti di terreni di coltura degli epatociti (HCM) (o 10 parti di acqua come un non-tessuto generici idrogel SPECIFICI). Nota: Altre modificato HA o gelatina possono essere aggiunti per rendere l&#39;estrusione bioink più agevolmente. Questo è descritto di seguito. </li></ol></li><li> Agitare la miscela risultante in alto (velocità 10 su 10) per 10 secondi per miscelare prima dell&#39;uso. &lt;/ Li&gt; <li> L&#39;uso di idrogel bioink <ol><li> Per l&#39;estrusione o il collaudo bioprinting, trasferire il composto in una cartuccia siringa o della stampante e lasciare reticolare spontaneamente per 30 minuti (fase 1 reticolazione) a 37 ° C. </li><li> Per le misure reologiche, trasferire il composto in da 35 mm piastra di Petri e lasciare reticolare per 30 min. Nota: La miscela comincia immediatamente reticolare tramite formazione di legami tiolo-acrilato e inizierà ad aumentare di viscosità. La miscela deve essere trasferito in una siringa, cartuccia di stampa, o posizione di destinazione entro 10 min per evitare l&#39;intasamento di una pipetta o una siringa durante il trasferimento. </li><li> Quando reticolazione secondario (fase 2) si desidera, irradiare la fase gel 1-reticolati con la luce ultravioletta (365 nm, 18 W / cm 2) per avviare una reazione di polimerizzazione tiolo-alkyne. Nota: durata dell&#39;irradiazione dipende dalla superficie del materiale. In generale, un centimetro quadrato di materiale richiede solo 1-2 sec di esposizione ai raggi UV a questo potere UV. </li></ol></li></ol> Compatibilità 2. Stampante Test <ol><li> Prima di test di integrazione con i dispositivi bioprinting, caratteristiche di prova di estrusione in panchina laboratorio con semplici test di estrusione usando siringhe standard e piccoli suggerimenti ago calibro (20-30 gauge). <ol><li> Spingere il bioink attraverso una siringa standard per raggiungere agevolmente filamenti estrusi di idrogel con poche o nessuna urti. Estrusione di linee o modelli semplici è sufficiente a determinare il successo. </li></ol></li><li> Per l&#39;integrazione bioprinter, caricare bioink preparati da loro pipettando in cartucce per stampanti, e consentire 30 minuti per il bioink di sottoporsi spontaneamente fase 1 di reticolazione all&#39;interno della cartuccia. Nota: Volume di bioink dipende dall&#39;applicazione specifica e deve essere determinato dall&#39;utente. Cartucce per stampanti possono assomigliare o essere siringhe che sono compatibili con il dispositivo bioprinter. </li><li> Valutare la compatibilità di estrusioneper bioprinting, stampando un motivo semplice utilizzando il bioink. Ad esempio, stampare un reticolo 7 x 7 mm composto da linee parallele. Applicare pressione (pressione pneumatica ad esempio, 20 kPa), mentre la testina di stampa si porta nel piano XY ad una velocità di circa 300 mm / min. Nota: i diametri degli ugelli delle testine di varie dimensioni possono essere usati, ma ugelli conici con aperture di diametro 400-500 mM sono ottimali per la stampa sferoidi nell&#39;intervallo 250-350 micron. <ol><li> Se i materiali estrusi sono nodosi o irregolari, vedere il punto 2.4, o ridurre la quantità di PEGDA per ammorbidire il materiale reticolato fase 1. formulazioni bioink adeguatamente preparato estrudere senza intoppi, permettendo la deposizione precisa nei modelli o architetture desiderati. Nota: Le procedure bioprinting uso descritto un dispositivo bioprinting 3-D progettato su misura in casa appositamente per il tessuto costruire la stampa 32 Come tale, i parametri di stampa specifici variano notevolmente per ogni tipo di dispositivo e richiedono testin.g dall&#39;utente. </li></ol></li><li> Per migliorare le proprietà di estrusione, non modificato integrare HA e gelatina per le bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, rispettivamente). </li></ol> 3. La convalida da Bioprinting con primari costrutti fegato <ol><li> Preparare 3-D sferoidi fegato cellula primaria per impiccagione metodi Drop come la componente cellulare 33 Nota: Bioprinting può essere eseguita senza sferoidi, ma con singole cellule sospese nei bioinks idrogel pure. Sferoidi sono impiegati qui per accelerare le interazioni cellula-cellula e costruire funzionalità. Il numero di sferoidi o cellule impiegate dipende dalla specifica applicazione e deve essere determinato dall&#39;utente. Queste procedure devono essere eseguite in condizioni sterili, utilizzando materiali sterili. <ol><li> Preparare HCM aggiungendo il contenuto scongelati del kit di componenti supplemento HCM ai media epatociti basale (HBM) e filtraggio sterile. <ol><li> Scongelare il supplemento componenti delle Nazioni Unitetil liquido. </li><li> Aggiungere i componenti supplemento (acido ascorbico, 0,5 ml; albumina sierica bovina [acidi grassi liberi], 10 ml; gentamicina solfato / amfotericina B, 0,5 ml; idrocortisone 21-emisuccinato, 0,5 ml, insulina, 0,5 ml; fattore di crescita epidermico umano ricombinante , 0,5 ml, trasferire, 0,5 ml) a 500 ml HBM. </li><li> filtro sterile attraverso un 0,45 micron o 0,22 micron filtro utilizzando un gruppo filtro bottiglia-top o un filtro di punta della siringa. </li></ol></li><li> Determinare la densità cellulare di epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate contando su un emocitometro dopo ogni tipo di cellula è stato scongelato in base alle istruzioni del fabbricante. </li><li> Combinare epatociti primari umani, cellule di Kupffer e cellule stellate in un rapporto 80:10:10 in numero di cellule in mezzi HCM che è stato riscaldato a 37 ° C in una provetta conica. Nota: Il volume del supporto da utilizzare dipende dal numero complessivo cella specifica per l&#39;applicazione e deve essere determinata da the utente. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 520 xga 20 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in mezzi HCM per ottenere una sospensione cellulare contenente 1.000 cellule per 40 mezzi microlitri. Il volume totale dipende dal numero di sferoidi prodotta. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare a 96 pozzetti formato appesi piastre goccia. Aggiungere un totale di circa 1.000 cellule in ciascun pozzetto in HCM e mantenere a 37 ° C, in 5% CO 2 per 3 giorni durante i quali formano sferoidi multicellulari. </li><li> Raccogliere sferoidi fegato dalla piastra goccia appeso con una pipetta. Trasferire in un tubo da 15 ml sterile. </li></ol></li><li> sferoidi fegato Bioprint a specifici fegato idrogel bioink <ol><li> Preparare una formulazione di fegato ECM contenenti idrogel bioink come descritto al punto 1, impiegando 8% PEGDA e l&#39;8% 8-Braccio PEG alkyne come reticolanti. Utilizzare questa combinazione per la sua capacità di resulting in un idrogel vicino a taglio modulo elastico al tessuto del fegato nativo. </li><li> Che i sferoidi depositano sul fondo della provetta conica in cui sono stati collocati nel passaggio 3.1.7. Questo varia in base alle dimensioni e alla densità sferoide, ma in genere si verifica entro 1-2 min. Rimuovere tutti i supporti con attenzione aspirando o con una pipetta. </li><li> Trasferire il volume desiderato di soluzione di idrogel bioink preparata al momento per il tubo conico contenente sferoidi. Generalmente, un volume adeguato è del 10% -25% superiore al volume del costrutto 3-D da stampare. pipetta con cautela su e giù per risospendere sferoidi nella soluzione idrogel bioink. Trasferimento in una cartuccia bioprinter utilizzando una pipetta o una pipetta sierologica. </li><li> All&#39;interno della cartuccia bioprinter, lasciare che la soluzione di sottoporsi primo stadio di reticolazione (reazione tiolo-acrilato) per 30 min. Nota: A seconda delle dimensioni sferoide, la cartuccia può essere necessario lentamente ruotato o può avere bisogno di essere miscelato con i contenutiuna spatola sterile per mantenere sferoidi distribuiti nel bioink durante la fase 1 di reticolazione. Questo è meno di una necessità per bioinks preparati con cellule sospese invece di sferoidi. Nota: Dopo la fase 1 di reticolazione, gli utenti hanno una finestra operativa di diverse ore. Tuttavia, si raccomanda di eseguire il processo bioprinting rapidamente per migliorare la vitalità cellulare. </li><li> A seguito di fase 1 di reticolazione, utilizzare un dispositivo bioprinting per creare strutture di idrogel desiderati contenenti sferoidi fegato primari (o altre cellule). Nota: Questa tecnologia fornisce un sistema per biofabricating un&#39;ampia varietà di strutture. Parametri come volume totale, il numero di cellule o sferoidi, la geometria struttura stampata, e il substrato su cui sono stampati costrutti sono altamente dipendenti dagli obiettivi dell&#39;utente. </li><li> Dopo la deposizione nella configurazione desiderata, amministrare luce UV per 2-4 secondi per avviare il meccanismo di reticolazione secondaria, stabilizzando la constructs e aumentando la rigidità al livello desiderato. Nota: La concentrazione di PEG-alchino, e quindi la densità di reticolazione finale complessiva, controlla primariamente la rigidità costrutto finale. </li><li> Ripetere la 3.2.4 e 3.2.5 passaggi per creare costrutti multistrato. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diverse componenti che sono fondamentali per prendere in considerazione quando si cerca di biofabricate 3-D costrutti di tessuto, per l&#39;uso eventuale negli esseri umani o per applicazioni di screening in vitro. Impiegando i componenti cellulari appropriati determina il potenziale funzionalità end, mentre il dispositivo biofabrication si determina la metodologia generale per raggiungere il costrutto finale. Il terzo componente, il biomateriale, è altrettanto importante, in quanto serve un doppio ru...

Negli ultimi anni, una varietà di tecnologie sono diventate disponibili che risponde alla necessità di fonti alternative di organi funzionali e tessuti cercando di fabbricare o biofabricate, li. Bioprinting è emerso come uno dei più promettenti di queste tecnologie. Bioprinting può essere pensato come una forma di robotica additivo fabbricazione di parti biologiche, che può essere utilizzato per costruire o modello praticabile strutture organo-simili o tessuto-come in 3 dimensioni. 1 Nella maggior parte dei casi, bioprinting impiega un 3-dimensionale (3 -D) dispositivo di stampa che è diretta da un computer per depositare cellule e biomateriali in posizioni precise, riassumendo così anatomicamente imitano architetture fisiologici. 2 Questi dispositivi stampare una &quot;bioink&quot;, che può assumere la forma di aggregati di cellule, cellule incapsulate in idrogel o fluidi viscosi, o microcarriers cellulari testa di serie, così come i polimeri privi di cellule che forniscono struttura meccanica o agire come PLA cell-freeceholders. 3,4 A seguito del processo bioprinting, la struttura risultante può essere maturata in strutture tessuto o organo funzionale, e utilizzati per la sua applicazione finale previsto. 5,6 Fino ad oggi, un organo completo a misura d&#39;uomo completamente funzionale non è stato stampato, ma rimane l&#39;obiettivo principale a lungo termine della bioprinting ricerca e sviluppo. 2 Tuttavia, su piccola scala &quot;organoide&quot; costrutti di tessuto sono attualmente in corso di attuazione in una serie di applicazioni, tra cui la modellazione patologia, lo sviluppo di farmaci, e lo screening tossicologico. Uno dei principali ostacoli che i ricercatori hanno incontrato nell&#39;applicazione della tecnologia bioprinting è che ben pochi materiali sono stati sviluppati per l&#39;esplicito scopo di bioprinting. Per avere successo in modo efficace in bioprinting, un biomateriale deve soddisfare 4 requisiti fondamentali. Il biomateriale deve avere 1) le proprietà meccaniche appropriate per consentire la deposizione (sia estrusione attraverso un ugello come un gel o un inkjet come una gocciolina), 2) la capacità di mantenere la sua forma come componente di una struttura 3-D dopo la deposizione, 3) la capacità di controllo utente delle 2 caratteristiche precedenti, e 4) ambiente amichevole e solidale una cella a tutti fasi della procedura bioprinting. 7 Storicamente, bioprinting lavoro è spesso cercato di impiegare biomateriali tradizionali esistenti in dispositivi bioprinting senza considerazione per la loro compatibilità, invece di progettare un biomateriale per avere le proprietà necessarie per bioprinting e successive applicazioni di post-stampa. Una varietà di bioinks sono stati sviluppati di recente per migliore interfaccia con l&#39;hardware deposizione e di fabbricazione. sistemi di idrogel standard pongono notevoli problemi perché esistono in generale sia come precursore di soluzioni fluide con insufficienti caratteristiche meccaniche, o idrogel polimerizzati che se stampati possono ostruire gli ugelli o diventano rotto sul processo di estrusione. La nostra squadra, così come OtheRS, hanno esplorato varie formulazioni idrogel per affrontare questi problemi, tra cui la stampa bioprinting sferoide cella in substrati idrogel, 5,8 cellulare e idrogel filamento di estrusione da tubi microcapillari, 9-11 estrudibili acido ialuronico (HA) idrogel nanoparticelle -Gold con proprietà di reticolazione dinamiche , 12 controllo temporale della rigidità idrogel usando fotopolimerizzabile metacrilato HA e la gelatina, 13 reticolazione a base di fibrinogeno-trombina, 14,15 a scambio ionico gel alginato-collagene, 16 e recentemente rapida polimerizzazione luce ultravioletta (UV) reticolazione iniziati con, 17 Questi esempi dimostrano la fattibilità di materiali che generano che può venire bioprinted efficace. Tuttavia, in aggiunta all&#39;integrazione con hardware, per generare successo costrutti tissutali vitali e funzionali 3-D, biomateriali devono contenere segnali biochimici e meccanici che aiuti nel mantenimento cellularevitalità e funzionalità. Questi fattori aggiuntivi, profili biochimici e meccanici, possono avere un&#39;influenza significativa sulla funzione di successo di costrutti di tessuto bioprinted. Sia le cellule e la matrice extracellulare nativa (ECM) sono responsabili di presentare una vasta gamma di molecole di segnalazione come fattori di crescita e altre citochine ad altre celle. La combinazione di questi segnali varia da tessuto a tessuto, ma può essere estremamente potente e influente nella regolazione del comportamento delle cellule e dei tessuti. 18 Impiegando componenti ECM tessuto-specifici da organi diversi e attuazione come idrogel o come parte di un idrogel è stata esplorata con successo. 19-21 Questo approccio, che comprende decellularizing un determinato tessuto, polverizzazione, e dissolverla, può essere utilizzato per produrre segnali biochimici tessuto-specifici da qualsiasi tessuto e possono essere incorporati in 3-D costrutti idrogel. 22 Inoltre,è ampiamente documentato che i tessuti del corpo occupano una vasta gamma di impedenze. 23 Pertanto, la possibilità di regolare le proprietà meccaniche dei biomateriali, quali il modulo elastico E &#39;o tranciare modulo elastico G&#39;, è uno strumento utile in ingegneria tissutale . Come descritto sopra, il controllo bioink proprietà meccaniche consente biofabrication estrusione-basato usando gel morbido, che può poi ulteriormente manipolato da reticolazione secondaria in un momento successivo, in cui i livelli di modulo elastico possono essere raggiunti che corrisponde a quella del tipo organo bersaglio. Ad esempio, biomateriali possono essere personalizzati per abbinare una rigidità di 5-10 kPa come un fegato nativo, 23 o abbinare una rigidità di 10-15 kPa come tessuto cardiaco nativo, 24,25 in teoria aumentare la capacità di questi organoidi di funzionare in un modo simile alle loro controparti tessuto nativo. L&#39;influenza della rigidità dell&#39;ambiente sul fenotipo cellulare è stato explored negli ultimi anni, in particolare rispetto alle cellule staminali. Engler et al. Hanno dimostrato che l&#39;elasticità del substrato aiutato a guidare le cellule staminali mesenchimali (MSC) verso linee con elasticità dei tessuti corrispondente a quello del substrato. 25 Questo concetto è stato ulteriormente esplorato per la differenziazione in muscolo, la funzione cardiaca, fenotipo fegato, staminali ematopoietiche proliferazione cellulare e manutenzione di potenziale terapeutico delle cellule staminali. 24,26-29 Essendo in grado di sintonizzare un idrogel di diversi moduli di elasticità è una caratteristica importante di un biomateriale che verrà utilizzato per biofabricate costrutti tissutali. 30 Qui si descrive un protocollo che rappresenta un approccio versatile utilizzato nel nostro laboratorio per formulare un sistema idrogel che può essere estruso bioprinted e personalizzata per 1) contenere il profilo biochimico di un particolare tipo di tessuto e 2) mimare il modulo elastico di tale tipo di tessuto . Affrontando questi requisiti, ci proponiamo di provide un materiale che può riassumere le caratteristiche fisico-chimiche e biologiche di in vivo tessuto. 31 Il sistema composito idrogel modulare descritta sfrutta un approccio multi-reticolazione per produrre bioinks estrudibili, e permette una reticolazione secondaria per stabilizzare e aumenta la rigidità della prodotti finali per abbinare una vasta gamma di tipi di tessuto. personalizzazione biochimica viene soddisfatta utilizzando componenti ECM tessuto-specifici. A dimostrazione, ci avvaliamo di una varietà specifica di fegato di questo sistema idrogel per Bioprint fegato funzionale costrutti organoide. Il protocollo descritto utilizza un dispositivo bioprinting 3-D personalizzato. In generale, questo protocollo può essere adattato alla maggior parte delle stampanti estrusione-based, parametri di stampa specifici variano notevolmente per ciascun tipo di dispositivo e richiedono test dall&#39;utente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="903">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hyaluronic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">53747</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Gelatin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6144</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">410896</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:340px;">Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP)</td>
			<td style="width:108px;">ESI-BIO</td>
			<td style="width:119px;">GS315</td>
			<td style="width:336px;">Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa</td>
			<td style="width:108px;">Creative PEGWorks</td>
			<td>PSB-887</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human hepatocytes</td>
			<td style="width:108px;">Triangle Research Labs</td>
			<td>HUCPM6</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Primary human liver stellate cells</td>
			<td style="width:108px;">ScienCell</td>
			<td style="width:119px;">5300</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Primary human Kupffer cells</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">HUKCCS</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hepatocyte Basal Media (HBM)</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3199</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:340px;">Hepatocyte Media Supplement Kit</td>
			<td style="width:108px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-3198</td>
			<td style="width:336px;">HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5mL; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 mL; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5mL; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 mL; insulin, 0.5 mL; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 mL; transferring, 0.5 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:340px;">Ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:108px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A669</td>
			<td style="width:336px;">Other manufacturers are ok.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Fresh porcine cadaver tissue</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Freezer mill</td>
			<td style="width:108px;">any</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:340px;">Bioprinter</td>
			<td style="width:108px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:336px;">The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:340px;">Hanging drop cell culture plate</td>
			<td style="width:108px;">InSphero</td>
			<td>CS-06-001</td>
			<td style="width:336px;">InSphero GravityPlus 3D Culture Platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

Quando le procedure sopra descritte vengono seguite correttamente, idrogel dovrebbero contenere un profilo biochimico specifico per il tipo di tessuto bersaglio, 20 permettono un elevato grado di controllo su bioprinting e modulo elastico finale, 34 e supportano cellule vitali funzionali nei costrutti tissutali. idrogel Personalizzazione Per meglio fegato nativo mimica, la bioink i...

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Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Costruisce Utilizzando un tessuto-specifici idrogel Bioink

Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l&#39;utilizzo in applicazioni di screening in vitro.

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.6K Views.  Wake Forest Univeristy Health Sciences.  Descriviamo un insieme di protocolli che, insieme, forniscono un bioink idrogel tessuto-mimando con le quali costrutti di tessuto 3-D funzionali e vitali possono essere bioprinted per l'utilizzo in applicazioni di screening in vitro. 

Video: Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Sintesi di una proteina artificiale mediata da inteina Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

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Bioingegneria

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingegneria 3D Cellularized collagene Gel per Vascolare Rigenerazione Tissutale

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilità di Bioprinted cellulari Costruisce Utilizzando un dispenser stampante cartesiana Tre

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Tecnica Automated robotica erogazione di orientamento della superficie e Bioprinting di celle

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Multimateriali di cartilagine e pelle tessuto analoghi utilizzando un romanzo passivo unità tecnica di miscelazione per Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Progettazione di una stampante 3D Open-Source, a basso costo per l'estrusione di bioink e di fusione alimentare

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

Protocolli di biostampa 3D di Gelatin Abasecryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Utilizzo di Bioinchiostro idrogel multistrato nella biostampa tridimensionale per la distribuzione omogenea delle cellule

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...