Name: establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da un seme di Grant cervello Research Foundation (BRFSG-2014-02) per Helen Bateup. Dirk Hockemeyer è un nuovo Scholar in invecchiamento della Ellison Medical Foundation ed è supportato dalla Fondazione Glenn così come The Shurl e Kay Curci Foundation. DH è supportato anche dal NIH concedere 1R01CA196884-01.

Le procedure descritte in questo manoscritto sono stati esaminati e approvati dal Comitato di Sorveglianza di ricerca dell&#39;Università di Berkeley Stem Cell. 1. Preparare cellule staminali per la modifica <ol><li> Crescere e cellule staminali pluripotenti cultura umana (hPSCs) su un 6-pozzetti contenenti 2,4 × 10 6 cellule / piastra di topo mitomicina C-inattivato fibroblasti embrionali (MEF) alimentatori coltivate su gelatina 32. Mantenere hPSCs in 3 ml di mezzi cellule staminali embrionali umane per bene (i media hESC) e crescere in un 37 ° C incubatore con il 3% O 2/5% di CO 2. Nota: Per il successo di questo protocollo, non è necessario mantenere hPSCs in un incubatore a basso ossigeno; tuttavia è importante notare che hPSCs proliferano più velocemente in un ambiente di alta O 2, così tempi e cellulari devono essere regolati di conseguenza. Va inoltre notato che hPSCs mantenuto in ossigeno basso hanno tassi più bassi di differenziazione spontanea 33. <ol><li> To fanno dei media da 500 ml hESC combinano 380 ml DMEM / F12, 75 ml di siero fetale bovino (FBS), 25 ml di siero sostituzione KnockOut (KSR). Aggiungere glutammina (1 mM concentrazione finale), 5 ml di 100x non essenziale aminoacidi, 100 unità / ml penicillina-streptomicina (P / S), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) (4 ng / ml concentrazione finale), e 2- mercaptoetanolo (5.5 micron concentrazione finale). </li></ol></li><li> Cambiare mezzi rimuovendo intero volume di supporti (3 ml) usando una pipetta di vetro e di vuoto. Sostituire con materiale hESC 3 ml caldo con una pipetta sierologica. Ripetere i media cambiano ogni giorno fino a quando hPSCs sono circa il 50% confluenti (Giorno -1). </li><li> Un giorno prima di targeting (Giorno -1), cambiare i media hESC, rimuovendo i vecchi media e l&#39;aggiunta di supporti hESC caldi integrato con 10 micron Y-27632. </li><li> Anche il giorno -1, preparare uno o due 6 pozzetti o 10 cm di resistenti ai farmaci cellule di alimentazione MEF da DR4 topi (2,4 × 10 6 celle / piastra) 34. Nota: In generale, 6 pozzetti sono annuncivantageous oltre 10 piatti cm, come essi ospitare più mezzi di comunicazione. 6 pozzetti anche assicurare che i cloni diverse da diversi pozzi sono indipendenti. Tuttavia, una piastra 10 cm consentirà più facile raccolta, a seconda del microscopio per questo processo. </li></ol> 2. Modifica pluripotenti cellule staminali <ol><li> Preparare soluzioni di trasfezione pipettando 5 mg ciascuno di ZFN 1 e 2, TALEN 1 e 2, o 15 ug del CRISPR / Cas9 codifica px330 plasmide (Figura 1) in una provetta da 1,5 ml. Dispensare 30 microgrammi di plasmide riparazione in questo tubo pure. Infine, pipetta 1x tampone fosfato (PBS) nel tubo per portare il volume fino a 300 ml. Nota: Preparare plasmidi come midiprep (qualsiasi kit è adatto) con una concentrazione minima di 300 ng / ml per mantenere il volume totale della soluzione di trasfezione meno di 300 microlitri. Non è necessario eseguire estrazione con fenolo / cloroformio, per linearizzare il plasmide, o utilizzare un endotoxin kit di preparazione plasmide gratuito. </li><li> Rimuovere i supporti da hPSCs utilizzando una pipetta di vetro e di vuoto. Pipettare 2 ml caldo 1x PBS in ciascun pozzetto per lavare le cellule. </li><li> Rimuovere la PBS immediatamente utilizzando una pipetta di vetro e di vuoto. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di 0,25% tripsina-EDTA direttamente su cellule in ogni pozzetto. Mettere in incubatrice (37 ° C / 5% di CO 2/3% O 2) per circa 10 minuti. o fino a quando feeder layer inizia a sollevare la piastra. </li><li> Aggiungere 2 ml di mezzi caldo esWash (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 unità / ml P / S) a ciascun pozzetto per arrestare la reazione tripsina. </li><li> Assicurarsi che le cellule di alimentazione staccarsi come un lenzuolo. Pipettare il contenuto di ciascun pozzetto in una singola provetta conica da 50 ml, che unisce tutti i pozzetti. Triturare le cellule con un 10 ml pipetta sierologica. Non è necessario rompere lo strato alimentatore; hPSCs verrà via dello strato dell&#39;alimentatore delicatamente triturazione. Ci dovrebbe essere di circa 15 ml di sospensione cellulare. </li><li> Aggiungere 25 ml di media esWash al tubo per portare il volumi fino a 40 ml totale. Consentire grossi pezzi di alimentazione di stabilirsi sul fondo della provetta per 1-2 min. Rimuovere il surnatante (~ 38 ml) dal tubo usando una pipetta sierologica e depositare in una nuova provetta conica da 50 ml. </li><li> Centrifugare per 5 min a 190 x g. Rimuovere il surnatante dal tubo usando una pipetta di vetro e di vuoto. Assicurarsi di non disturbare il pellet. Risospendere le cellule in 500 microlitri 1x PBS. Combinate con la soluzione plasmide trasfezione preparato in precedenza. Contare le cellule di questo passo. Utilizzare 5-10 milioni di cellule per elettroporazione. </li><li> Pipetta la sospensione intero 800 ml in un elettroporazione cuvetta 4 millimetri, immettere sul ghiaccio per 3-5 minuti. Cellule elettroporazione utilizzando il programma esponenziale sul sistema elettroporazione con i seguenti parametri: 250 V, 500 mF, ∞ resistenza, e 4 mm dimensioni cuvetta. Dopo elettroporazione, posizionare cuvetta di nuovo in ghiaccio per 3 min. Nota: Osservare la costante di tempo del elettroporazione sul sistema elettroporazione. La costante di tempovaria con numero di cellulare e la purezza del DNA. Trasfezioni di successo di solito hanno un tempo costante tra 10-14 msec quando si utilizzano le condizioni elencate e un generatore di impulsi gene II. Efficienza elettroporazione inferiori possono verificarsi quando costanti di tempo varia da questi valori. </li><li> Risospendere le cellule elettroporate in 18 ml di caldo hESC multimediale integrato, con 10 micron Y-27632. Tavola 3 ml di questa sospensione di cellule singole in ciascun pozzetto di una piastra 6 bene con cellule feeder DR4. Ritorno a incubatore (37 ° C / 5% di CO 2/3% O 2). </li></ol> 3. Selezione delle colonie positive <ol><li> Giorno 2, rimuovere tutti i media utilizzando una pipetta di vetro e di vuoto. Sostituire con 3 ml di mezzi hESC caldi integrato con 10 micron Y-27632. Giorno 3, rimuovere tutti i media utilizzando una pipetta di vetro e di vuoto. Sostituire con 3 ml di media hESC caldo senza includere Y-27632. Giorno 4, rimuovere tutti i media utilizzando una pipetta di vetro e di vuoto. Sostituire con 3 ml i media hESC caldi integrati con antibiotici per selectiin data. Ritorno a incubatore (37 ° C / 5% di CO 2/3% O 2). Nota: Il tipo di antibiotico utilizzato dipenderà dalla cassetta di resistenza inclusa nel modello di riparazione. Quando si lavora con WIBR # 3 hPSCs (NIH di registro 0079), 0,5 mg / ml puromicina, 70 mg / ml di G418 (geneticina), e 35 mg / ml igromicina sono stati utilizzati con successo. Le concentrazioni di selezione dovrebbero essere determinati empiricamente che istituisce la concentrazione minima di antibiotico necessario per uccidere le cellule wild-type entro una settimana circa. </li><li> Giorni 5-12, cambiano i media giornaliera, in sostituzione di vecchi media ogni volta con i media hESC caldi integrati con gli antibiotici. Nota: Aspettatevi una grande quantità di morte cellulare. Colonie individuali diventeranno evidenti intorno al giorno 8-10. Supporti regolare hESC senza antibiotici può essere utilizzato dopo 12-14 giorni di selezione continua. Se la densità cellulare è alto o morte cellulare è lento, acidificazione dei media dovrebbe essere evitata e può essere necessario aumentare le volu multimedialime (fino a 4-5 ml) durante i primi giorni di selezione. </li></ol> 4. Picking Colonie selezionati (giorno 12-14) <ol><li> Osservare le colonie il giorno 12-14. Osservate le colonie che sono pronti a raccogliere su un microscopio dissezione e di garantire che essi non contengono cellule che iniziano a differenziarsi. La dimensione approssimativa dovrebbe essere 800-1.200 micron. Se colonie raggiungono queste dimensioni prima del giorno 12, si raccomanda che essi dovrebbero essere raccolti poi. Nota: Per ogni esperimento di targeting, scegliere come molte colonie necessaria per garantire il genotipo desiderato viene isolato. A titolo di esempio, la modifica AAVS1 con il modello di riparazione AAV-CAGGS-EGFP ha dimostrato costantemente robusta integrazione, e richiede solo 12-24 colonie per essere raccolti per ottenere circa 5-10 cloni heterozygously mirati. Altri esperimenti mirati potrebbero richiedere più colonie da prelevare (Tabella 1). La frequenza degli eventi di targeting corretti dipende da fattori quali l&#39;efficienza del SSN introdurre un DSB, la dimensione dell&#39;inserto, e la strategia di selezione. Nel caso dell&#39;approccio trap gene per il locus AAVS1 qui presentata, il marcatore di selezione è espressa solo quando correttamente integrato al sito bersaglio, riducendo il numero di colonie necessarie per ottenere un clone correttamente mirato. </li><li> Un giorno prima della raccolta, preparare piastre da 12 pozzetti di MEF (2,4 x 10 6 cellule / piastra, saranno utilizzati un pozzetto per ogni colonia scelto). </li><li> Il giorno della raccolta, rimuovere tutti i supporti dalle 12 piatti ben MEF utilizzando una pipetta di vetro e vuoto e sostituirlo con 1 ml di mezzi hESC. Anche il giorno di raccolta, cambiare hESC media sulle piastre 6 e che stanno per essere raccolti. </li><li> Tirare pipette di vetro per la dissociazione meccanica delle colonie individuali dallo strato alimentatore. Abbassare le pipette su un bruciatore Bunsen-cappuccio e ammorbidito al punto di espansione fino vetro è malleabile. Eliminare rapidamente dal fuoco e tirare la pipetta a parte la creazione di un punto angolare. Rompere ilpunto circa 2 cm dall&#39;asse piegata, lasciando uno stretto canale. Lucidare la fine del canale esponendo alla fiamma per 1-2 sec. Nota: se si desidera scegliere colonie un puntale p20, tuttavia, questo può ridurre la clonalità della cultura, come la punta sordo può rimuovere una maggiore quantità di cellule da ciascuna colonia in media, potenzialmente contaminanti guadagni successivi. </li><li> Montare dispositivo raccolta prendendo un puntale di filtro p1000 e allegando un bulbo di aspirazione per l&#39;estremità più stretta. Inserire la pipetta di vetro tirato in la parte più larga. </li><li> Posizionare un 6-pozzetti di hPSCs da prelevare sul palco di un microscopio dissezione montato in una cappa di coltura di tessuti. Comprimere il bulbo del dispositivo di prelievo e accise delicatamente e tagliare un individuo colonia in 10-20 pezzi uguali dimensioni, facendo attenzione a non rilasciare pezzi nei media. Prendere asportati pezzi HPSC della colonia nella pipetta rilasciando la lampadina. Provate a prendere il meno media come possibile durante il trasferimento. </li><li> Trasfer la colonia individuo ad un singolo pozzetto di una piastra di MEF 12 pozzetti, comprimendo il bulbo di nuovo direttamente nel pozzo, rilasciando la colonia ormai spezzata. Etichettare ogni bene per consentire l&#39;identificazione univoca di unicellulari cloni derivati. Ripetere l&#39;operazione per il numero di colonie, se necessario, cambiando la pipetta di vetro ogni volta. Nota: le colonie di raccolto potrebbe richiedere del tempo per imparare. Si raccomanda che la pratica sperimentatore su alcune cellule di controllo prima di tentare di isolare colonie mirati. </li><li> Ritorno piastre da 12 pozzetti alla incubatore (37 ° C / 3% O 2/5% CO 2), dondolo delicatamente la prima piastra per evitare l&#39;accumulo di cellule nel mezzo di ciascun pozzetto. </li><li> Il giorno successivo e ogni giorno successivo, rimuovono tutto volume dei mezzi di comunicazione con una pipetta di vetro e di vuoto e sostituire con 1,5 ml di mezzi hESC caldo finché cellule sono circa il 50% confluenti (solitamente ciò richiede 10-12 giorni). </li><li> Dopo 10-12 giorni, scegliere uno di due colonie di ogni bene e trasferire ai nuovi 12-pozzetti MEF ricui ripetendo i passaggi 4,1-4,8 per generare un piatto replica. </li><li> Estrarre DNA (vedi sotto) dai restanti colonie in ciascun pozzetto delle piastre MEF originali. <ol><li> Rimuovere i supporti da tutti i pozzetti con una pipetta di vetro e di vuoto. Pipettare 1 ml 1x PBS viene eseguito su ciascun bene per lavare le cellule. Rimuovere PBS usando pipetta di vetro e di vuoto. Pipettare 250 microlitri di tampone di lisi cellulare (concentrazioni finali in H 2 O: 10 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml proteinasi-K) su ciascun pozzetto. Posto in incubatrice (37 ° C / 3% O 2/5% di CO 2) O / N. </li><li> Il giorno successivo, il contenuto della pipetta di ogni pozzetto in singole provette da 1,5 ml. Pipettare 250 ml di alcool isopropilico in ciascun tubo per precipitare il DNA. Agitare vigorosamente tubo. Un precipitato bianco deve essere visibile. </li><li> Spin ogni tubo obliquo per 3 min a 13.000 rpm in una centrifuga da tavolo. Dopo spin down, scartare il surnatante per decantazione in rifiuti liquidi. Un piccolo pellet di DNA deve rimanere attaccata al fondo diil tubo. Pipettare 250 ml di etanolo al 70% in ciascuna provetta per lavare il pellet di DNA. Agitare energicamente. Spin ogni tubo obliquo per 3 min a 13.000 rpm in una centrifuga da tavolo. </li><li> Dopo la filatura giù, scartare il surnatante per decantazione in rifiuti liquidi. Un piccolo pellet di DNA deve rimanere attaccato al fondo della provetta. Pipettare il resto del surnatante quindi non c&#39;è liquido rimasto nel tubo. Lasciare tubo aperto ad asciugare sul banco per 5-10 min. Dopo l&#39;essiccazione, risospendere il DNA in 250 microlitri di buffer TE. Posizionare a 37 ° C per 6 ore per consentire il DNA a sciogliere. </li></ol></li><li> Genotipo ogni campione utilizzando una strategia di pre-ottimizzato PCR o sud macchia. Nota:.. Per AAVS1 mira utilizzando il modello di riparazione AAV-CAGGS-EGFP, la strategia del sud macchia può essere trovato in Hockemeyer et al, 2009 4 Un protocollo assorbente del sud globale si trova nel sud, 2006 35 Per PCR multiplex genotipizzazione di. lo stesso esperimento, primer e le condizioni possono esseretrovati nella tabella 2 36. </li><li> Scartare pozzi che non sono adeguatamente mirati e continuare a cambiare i media hESC in cellule opportunamente mirati ogni giorno. Congelare le cellule quando sono circa il 50% confluenti, vedi sotto per il congelamento protocollo. <ol><li> Un giorno prima del congelamento, cambiare i media hESC, rimuovendo i vecchi media e l&#39;aggiunta di supporti hESC caldi integrato con 10 micron Y-27632. </li><li> Il giorno di congelamento preparare 0,5 ml ciascuna di soluzione A e la soluzione B per pozzetto di una piastra 12 pozzetti che viene congelata giù in due provette da 15 ml coniche. Geolocalizzazione su ghiaccio. Soluzione A: 50% dei media hESC e il 50% FBS; Soluzione B: 80% FBS e 20% dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Dissociarsi colonie HPSC nelle singole cellule prima del congelamento. Seguire i passaggi 2.2-2.8 per fare questo, il ridimensionamento dei volumi di conseguenza. Pellet cellulare Completamente risospendere in 0,5 ml di soluzione A. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di soluzione B di sospensione cellulare, pipetta su e giù per fare sospensione cellulare omogenea. Take il volume totale della sospensione cellulare (~ 1 ml) e deposito in cryotube 2 ml. Tappo a vite saldamente. </li><li> Posto cryotube in un congelatore ° -80 C O / N. Il giorno dopo il congelamento, rimuovere le cellule congelate da -80 ° C freezer e subito mettere in serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Il metodo presentato qui per isolare popolazioni omogenee di cellule staminali umane pluripotenti geni modificati è un approccio potente per la generazione di linee isogeniche HPSC che differiscono solo a livello del locus mirato. Queste cellule sono un sistema ideale per sondare i meccanismi di differenziazione cellulare umana e sviluppo, nonché per comprendere la fisiopatologia di malattie monogeniche in un ambiente controllato genetica. Come dimostrato qui, è possibile utilizzare tre strategie progettuali SSN indipendenti (ZFNs, Talens, e CRISPR / Cas9) per realizzare l&#39;integrazione mirata al locus AAVS1. Ciascuno di questi metodi ha i suoi vantaggi e svantaggi. Un vantaggio potenziale di ZFNs e, in una certa misura, Talens è la flessibilità del disegno, che consente ingegneria iterativo per migliorare la dominii singoli nucleasi 42 legame al DNA. Questa ottimizzazione nucleasi potrebbe aumentare la specificità della ZFNs e Talens là di ciò che è realizzabile con la CRISistema SPR / Cas9. Tale selettività può essere importante per applicazioni cliniche che richiedono un alto grado di specificità di destinazione. Il vantaggio principale del sistema / Cas9 CRISPR è la facilità d&#39;uso. Sebbene kit di costruzione Talen e ZFN sono stati messi a disposizione del pubblico (ad esempio, attraverso Addgene 21), CRISPR / SSNs basate Cas9 sono notevolmente più facili da costruire, come l&#39;unica personalizzazione necessaria è una coppia di oligonucleotidi 20 di base (quando si utilizza il plasmide px330 disegno 14). Questa semplicità si rivela vantaggiosa per laboratori di ricerca che desiderano includere la modifica del genoma nei loro studi. Ci sono tecniche di trasfezione alternative, tra cui nucleofection 43, per creare linee HPSC geni modificati; tuttavia elettroporazione ha dimostrato di essere efficace 4,5,25 coerenti ed economicamente. Nucleofection può essere utilizzato per trasfettare direttamente Cas9-guida i complessi RNA ribonucleoproteina nel nucleo, aumentando l&#39;efficienza di un SSNd fedeltà 44. Crescere hPSCs su MEF è un metodo affidabile e poco costoso da mantenere hPSCs in uno stato pluripotente, senza differenziazione eccessiva. Inoltre, esso permette una facile isolamento di colonie geneticamente identici. In alternativa, è possibile hPSCs cultura senza MEF, tuttavia queste condizioni di coltura può essere più costoso di culture fondate alimentazione. Inoltre, l&#39;intero processo è scalabile, consentendo l&#39;isolamento di modifica degli eventi molto rari o la generazione di molte linee cellulari distinti esperimenti montaggio parallelo. Il protocollo qui descritto è robusto; tuttavia ci sono diversi passaggi chiave che influenzano l&#39;efficienza con cui si possono ottenere cloni modificati correttamente. La componente più critico per questo metodo è avere MEF di alta qualità e resistenti ai farmaci MEF DR4. La sopravvivenza di singoli hPSCs è tenue, e MEFs bassa qualità impedirà l&#39;isolamento di linee HPSC indifferenziate. In secondo luogo, l&#39;uso di Y-27632 è anchechiave per consentire la sopravvivenza delle cellule unico senza generare una pressione selettiva per le cellule con un cariotipo anormale 45. In terzo luogo, la raccolta colonie ben distanziati assicura omogeneità genetica delle linee cellulari derivate. Infine, è importante preparare pipette di vetro in modo che l&#39;apertura è abbastanza piccolo per rompere la colonia in molti pezzi più piccoli, in modo che più colonie crescere nel nuovo pozzo. Questo permette la raccolta di sottocloni ben distanziati per un piatto replica di avere nella cultura, lasciando il piatto originale di colonie isolate per la genotipizzazione. Una parte difficile in questo protocollo è il manuale di trazione delle pipette di vetro; questo dovrebbe essere praticata in anticipo. Va notato che ci sono più tecniche di raccolta clone che non richiedono una pipetta di vetro. Gli sperimentatori sono incoraggiati a trovare quello che funziona meglio per loro. Ci sono limitazioni a questo protocollo che può essere superato con semplici modifiche. Un esperimento destinato a oolo interrompere il luogo di interesse, senza riparazione o uno il cui modello di riparazione non contiene una cassetta di selezione, deve utilizzare un altro metodo di arricchimento per le cellule che sono state modificate. Si noti che il numero di colonie che devono essere raccolti per trovare un clone positivo aumenta notevolmente in assenza di selezione. Una strategia per migliorare l&#39;efficienza è co-trasfezione un plasmide non integranti che esprime una proteina fluorescente. Dopo permettendo alle cellule di recuperare per due giorni, le cellule mirate possono essere ordinati su fluorescenza positiva utilizzando la fluorescenza-attivato l&#39;ordinamento delle cellule e ripiastrate 29. Questo processo arricchisce di cellule che sono state trasfettate con i plasmidi di elettroporazione e quindi aumenta la probabilità di un evento di editing concomitante nella cellula. Le tecniche qui descritte possono essere estesi ad utilizzare più RNA guida per indirizzare simultaneamente diversi loci 14,46,47. Sono stati stabiliti molti protocolli di differenziare hPSCsin tipi di cellule diverse, consentendo varie manipolazioni genetiche in tipi cellulari di interesse 30. Nel complesso, abbiamo dimostrato il potenziale per un efficiente modifica del genoma in hPSCs indipendentemente dalla scelta SSN. Si propone che questa tecnica può essere adattato per creare linee isogeniche HPSC che sono state gene-modificati in qualsiasi locus genomico.

Tecnologie di modifica del genoma stanno rapidamente evolvendo in strumenti standard per la biologia molecolare e cellulare 1. L&#39;ingegneria genetica di cellule umane staminali pluripotenti (hPSCs) è di particolare interesse come hPSCs rappresentano una fonte di auto-rinnovamento delle cellule umane primarie geneticamente intatte. hPSCs possono essere differenziati in vari tipi di cellule per la modellazione della malattia o come fonte per le terapie di trapianto 2,3. Ha dimostrato qui è un protocollo che utilizza tre diversi tipi di nucleasi site-specific (SSN) in combinazione con i meccanismi endogeni di riparazione del DNA per l&#39;integrazione mirata di un costrutto giornalista nel locus AAVS1. Dopo trasfezione di SSNs in hPSCs, dimostriamo come isolare popolazioni di cellule isogeniche ospitare il giornalista. La capacità di manipolare il genoma, in particolare pluripotenti staminali genomi di cellule, utilizzando SSN non è un fenomeno nuovo, come l&#39;utilità di nucleasi dita di zinco (ZFNs) e trascrizione attivata sianucleasi effettrici o simili (Talens) per la modifica del gene è stata dimostrata diversi anni fa 4-10. Tuttavia, con l&#39;avvento di S. pyogenes CRISPR / tecnologia Cas9 11-13, editing gene è diventato ampiamente accessibili 14. Tutti SSNs introducono una doppia interruzione di DNA filamento (DSB) presso il sito di destinazione specificata 1,4,5,11 che viene riparato da meccanismi cellulari endogeni utilizzando riparazione non omologa end-joining (NHEJ) o omologia diretto (HDR) 15. NHEJ è soggetto a errori e può introdurre mutazioni frame-shift con conseguente perdita della funzione del gene, mentre HDR permette di nuovi elementi da introdurre attraverso la co-trasfezione di un modello di riparazione con il SSN. Mentre i principi alla base di riparazione del DNA che facilitano l&#39;editing gene sono pensati per essere in gran parte la stessa per ogni SSN, alcune differenze tra le piattaforme possono essere osservato. De novo design ZFNs consente flessibilità e ottimizzazione nucleasi 16, tuttavia l&#39;uso di pubblicamentebiblioteche di montaggio disponibili e strumenti di screening per progettare i singoli ZFNs può richiedere molto tempo. Una volta che il luogo desiderato per il targeting ZFN-mediata è determinato, coppie ZFN possono essere progettati con lo strumento online ZiFit 17. Dopo la progettazione, ZFNs può essere modulare assemblato attraverso vari cicli di plasmide clonazione 18. In alternativa, ci sono molti disponibili in commercio, ZFNs preconvalidati 19. Nucleasi TALE possono anche essere progettati utilizzando strumenti online e componenti disponibili pubblicamente 17,20. Ad esempio, Talens può essere rapidamente assemblato da blocchi di cinque ripetizioni racconto, attraverso il montaggio FLASH 21 o mediante PCR basato gerarchica Golden Gate complesso 22. Facilità di progettazione SSN e la velocità di costruzione utilizzando CRISPR / Cas9 hanno fatto genoma modifica di uno strumento ampiamente accessibile. La breve guida di RNA-mediata di mira CRISPR / Cas9 consente anche di multiplazione di RNA guida per indirizzare diversi loci con un unico costrutto 14. Il designdi Cas9 per la modifica genetica richiede solo l&#39;individuazione di un motivo adiacente protospacer (PAM, un trinucleotide NGG per S. Pirogeni Cas9) prossimale al locus bersaglio. Inserendo un oligonucleotide corrispondente ai 20 coppie di basi 5 &#39;del PAM nel plasmide px330 14, il costrutto può essere assemblato in un passo clonazione. Oltre a S. pyogenes Cas9, Cas9 da N. meningitidis (NmCas9) che riconosce un 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;(PAM) ha dimostrato di consentire efficiente gene-editing in hPSCs 23. Oltre alle differenze nella facilità di progettazione SSN, ogni piattaforma ha proprietà specifiche. Ad esempio, ZFNs e Talens utilizzano il dominio nucleasi FokI, che genera un quattro nucleotidi 5 &#39;sbalzo 24 mentre Cas9 è pensato per generare la maggior parte smussare DSBs indeterminato. ZFNs, Talens e Cas9 differiscono nella loro stabilità della proteina, tasso on-off sul DNA bersaglio, e la modalità di scansione DNA, i quali could teoricamente comportare piccole differenze nei risultati editing 1. Mentre saranno necessari ulteriori studi per comprendere appieno le conseguenze di queste differenze, si descrive qui un protocollo che sia molto robusto in tutte e tre le piattaforme e può essere utilizzato per generare facilmente hPSCs geneticamente modificati. Indipendentemente dalla scelta SSN, elettroporazione è una procedura affidabile per trasfettare SSNs e modelli di riparazione omologia in hPSCs 25. Il numero di sopravvivere colonie dopo la selezione per la resistenza agli antibiotici dipende da parametri specifici del locus e la strategia di modifica (ad esempio, le dimensioni di inserto transgenico e le modalità di selezione). Il protocollo descritto qui di solito si traduce in circa 150-400 colonie cella singola derivati. -Gene editing al locus AAVS1 utilizzo di questo protocollo è stato precedentemente utilizzato per dimostrare l&#39;efficacia di SSNs 4,5. Il modello di riparazione AAV-CAGGS-EGFP utilizza una str trappola geneategy conferire resistenza puromicina in modo specifico locus. In breve, il modello di riparazione contiene un sito splice accettore monte della cassetta promoterless resistenza puromicina. Su corretta integrazione nel primo introne del gene PPP1R12C al locus AAVS1, la cassetta di resistenza è espresso dal promotore del gene modificato. La robustezza di questo test AAVS1 specifica ci permette di confrontare l&#39;efficienza di ogni piattaforma SSN. Editing gene utilizzando SSNs è potente data la capacità di interrompere e / o modificare teoricamente qualsiasi gene. Applicando questa strategia hPSCs fornisce versatilità hPSCs possono essere successivamente differenziate in una moltitudine di tipi di cellule umane come i neuroni 26, epatociti 27 e 28 cardiomiociti. Inoltre, l&#39;uso di cellule staminali pluripotenti indotte derivati ​​da pazienti consente la riparazione o l&#39;introduzione di mutazioni patogeni noti in un background genetico specifico paziente 29 </sup&gt;, Fornendo una piattaforma da cui partire per indagare i meccanismi della malattia e terapie di prova che utilizzano le proprie cellule del paziente 30. In sintesi, la modifica gene in hPSCs è un approccio efficiente e versatile per studiare la biologia di base dello sviluppo umano e della malattia 31.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, plugged</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation

Genome-editing di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) fornisce una piattaforma geneticamente controllata e clinicamente rilevante da cui partire per comprendere lo sviluppo umano e indagare la fisiopatologia della malattia. Utilizzando nucleasi site-specific (SSN) per la modifica del genoma, la rapida derivazione di nuove linee HPSC ospitano specifiche alterazioni genetiche in un ambiente altrimenti isogenico diventa possibile. Zinc finger nucleasi (ZFNs), trascrizione nucleasi attivatore-come effettrici (Talens) e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) / Cas9 sono i SSNs più comunemente utilizzati. Tutti questi nucleasi funzionano con l&#39;introduzione di una doppia interruzione di DNA incagliato in un sito specificato, promuovendo in tal modo preciso l&#39;editing gene ad un locus genomico. SSN-meditato editing genoma sfrutta due dei meccanismi endogeni della cellula di riparazione del DNA, che unisce non omologhe fine (NHEJ) e omologia riparazione diretta (HDR), a uno introdurre inserzione / delezione mutazioni o alter il genoma utilizzando un modello di riparazione omologa al sito della doppia interruzione filamento. L&#39;elettroporazione di hPSCs è un mezzo efficace per trasfezione SSNs e modelli di riparazione che incorporano i transgeni come reporter fluorescenti e cassette di resistenza agli antibiotici. Dopo l&#39;elettroporazione, è possibile isolare solo le hPSCs che incorporavano il costrutto riparazione selezionando per la resistenza agli antibiotici. Meccanicamente separando colonie HPSC e confermando la corretta integrazione al sito bersaglio attraverso genotipizzazione consente l&#39;isolamento di linee cellulari sono correttamente orientati e geneticamente omogenee. La validità di questo protocollo è dimostrato qui utilizzando tutte e tre le piattaforme del SSN per incorporare EGFP e una resistenza puromicina costruire nel AAVS1 sicuro locus porto di cellule staminali pluripotenti umane.

Qui mostriamo un protocollo compatibile con tre diverse piattaforme SSN per creare linee HPSC geneticamente modificati. Abbiamo mirato WIBR # 3 cellule staminali embrionali umane a livello del locus AAVS1 utilizzando ZFNs precedentemente pubblicati 4, 5 e Talens CRISPR / Cas9s 37 utilizzando un modello di riparazione che introduce un reporter EGFP e una cassetta di resistenza puromicina 4. Abbiamo coltivato i nostri hPSCs su MEF per un flusso di lavoro di coltura cellulare che consente il mantenimento e l&#39;espansione delle hPSCs indifferenziate (Figura 2), che è anche conveniente e scalabile. Se le cellule sono coltivate più del necessario vi è il rischio di maggiore differenziazione, riducendo il numero di cellule pluripotenti che sono trasfettate e quindi il numero di colonie HPSC mirati correttamente ottenuti. Noi electroporated 5.0 x 10 6 cellule per piattaforma SSN e placcato le cellule di ogni mira su un singolo piatto ben 6 di DR4 MEF. Dopo la selezione, ogni piattaforma ha provocato colonie EGFP-positivi (Figura 3) e una combinazione di non mirati, omozigosicamente mirate e heterozygously mirate cloni (Figura 4A, B, tabella 3). Nelle condizioni qui presentati, troviamo che la AAVS1 Talens provocato la maggior parte dei cloni EGFP-positivi. Il modello di riparazione utilizzato per questo esperimento consiste di un sito accettore splice monte del reporter e resistenza puromicina cassette EGFP. Usando questa strategia &quot;gene-trap&quot; (Figura 1), il costrutto deve inserire nel primo introne del locus AAVS1, utilizzando il promotore endogeno per guidare l&#39;espressione della cassetta puromicina-resistenza. La mancanza di un promotore guida l&#39;espressione del gene di resistenza puromicina all&#39;interno del modello di riparazione dovrebbe impedire espressione nella<html> evento di integrazione casuale. Pertanto, ci aspettiamo che tutti i cloni puromicina-resistenti dovrebbero essere mirate presso il sito AAVS1. Va notato che un sottogruppo di cloni trasportare integrazioni aberranti nel locus AAVS1 che sono rilevabili da Southern blot utilizzando una sonda interna, ma non dalla maggior parte delle strategie di PCR (Figura 1; Figura 4C) 4. Questi eventi di integrazione sono più probabilmente il risultato di eventi rivolti eterologhi che portano a più integrazioni del plasmide donatore 4. Abbiamo scelto 24 colonie da ogni esperimento SSN e ha scoperto che tutte le piattaforme avevano efficienze molto alte di targeting e ha mostrato differenze solo minime. Come interrogato mediante PCR, CRISPR / Cas9 dato i cloni più correttamente mirata, mentre la piattaforma TALEN aveva i cloni più omozigosicamente mirati (Tabella 3). /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. Schema del gene modificato AAVS1 locus utilizzando il modello di riparazione AAV-CAGGS-EGFP. Modificato da Hockemeyer et al., 2009. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Le colonie di WIBR # 3 celle. Immagini rappresentative in campo chiaro di colonie di WIBR # 3 cellule staminali embrionali umane prima di targeting. Si noti la mancanza di differenziazione e la chiara separazione dal feeder layer in una colonia ideale (a sinistra) al contrario di una non ideale (a destra). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. EGFP-positivi WIBR # 3 celle. Immagini rappresentative della WIBR # 3 cellule bersaglio con un modello di riparazione-EGFP esprimere al locus AAVS1. Immagini di colonie rappresentative modificati con ZFNs, Talens e CRISPR / Cas9 vengono mostrati. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. strategie di genotipizzazione per confermare il corretto il targeting. (A) Rappresentante PCR risultati genotipizzazione mostrano non mirati, eterozigoti ed omozigoti cloni mirati attraverso tre piattaforme SSN. WT CTL = controllo wild-type. (B) Reprerappresentative risultati macchia del sud mostrano una eterozigoti mirato clone di un clone e mirata omozigote rilevata con sonda esterna a 3 &#39;. Dimensioni frammento: WT-6.5 kb, a cura-6.9 kb. (C) Risultati rappresentativi Southern blot mostrano un clone adeguatamente modificato e un clone eterozigote con un non casuale doppio integrazione. Dimensioni: Frammento. Correttamente modificato-6.9 kb, aberranti ulteriore integrazione a 5 kb <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Studio </td><td> Gene mirata </td><td> Piattaforma </td><td> Riparazione tipo di modello </td><td> # Di cloni raccolse </td><td> Targeting efficienza </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> non dichiarata </td><td> non dichiarata </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td> Hygromycin </td><td> non dichiarata </td><td> non dichiarata </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> 14,9% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> 91.0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> 13,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-geneticina </td><td> 139 </td><td> 94,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al. &lt;/ em&gt;, 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-geneticina </td><td> 30 </td><td> 93,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-geneticina </td><td> 154 </td><td> 92.0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Reporter-geneticina </td><td> 11 </td><td> 45,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> non dichiarata </td><td> 30,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> non dichiarata </td><td> 14,0% </td></tr><tr><td> Soldner et al., 2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> 1,0% </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Descrizione di altri geni mirati utilizzando questo metodo, con correcor- mira efficienze tratti da studi pubblicati in precedenza. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Locus </td><td> Sequenza </td><td> Gli appunti </td></tr><tr><td> AAVS1-F Primer </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> Condizioni di PCR: T m = 57 ° C, 35 cicli </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R Primer </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> Banda WT: 1273 bp </td></tr><tr><td> AAVS1-mirata-R Primer </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Banda mirata: 992 bp </td></tr><tr><td> T2-Cas9-guida </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> Dal Mali et al., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-destra </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Da Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-sinistra </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Da Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-destra </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Da Hockemeyer et al., 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-sinistra </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Da Hockemeyer et al., 2011 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei primer e SSN sequenze di targeting. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Targeting Construct </td><td> Numero di EGFP + Colonie </td><td> Cloni raccolte mirate (PCR verificato) </td><td> Precedente Segnalato corretta efficienza Targeting (da Southern blot) </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86,9% (73,9% het / 13,0% omo) </td><td> 56% (50% het / 6% omo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91,3% (47,8% het / 39,1% omo) </td><td> 47% (37,5% het / 9,3% omo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95,7% (69,5% het / 26,3% omo) </td><td> non dichiarata </td></tr></tbody></table> Tabella 3. numeri comparativi di EGFP-positivi e mirati TALEN, ZFN e CRISPR / Cas9 colonie di cellule staminali umane. PCR verificate integrazioni a livello del locus AAVS1 per questo esperimento sono rispetto al Southern blot verificato adeguate singole integrazioni in esperimenti precedenti 4,5.

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Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K Views.  University of California, Berkeley. Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance. 

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, selezione, e Colonia-picking di cellule staminali umane pluripotenti indotte TALEN-mirati con Gene GFP nel AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Genetica

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Trasfettando e Nucleofecting umani cellule staminali pluripotenti indotte

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Biologia

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

Generazione rapida ed efficace delle ricombinante cellule staminali umane pluripotenti da ricombinasi mediata scambio Cassette in<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Medicina

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...