Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Gli autori ringraziano il team tecnico e OEM a Gilson, INC per il supporto tecnico esteso.

Gli autori MKC, MJG, EEB, NJD e RO sono o erano al tempo dei dipendenti per lo sviluppo di InvivoSciences, INC che ha concepito e sviluppato dei protocolli robotici qui descritti. TW è il CSO per InvivoSciences INC. SH è un dipendente di Gilson INC.

Nel presente studio abbiamo sviluppato un metodo di coltura per la produzione robotizzata IPSC che miniaturizza e automatizza l&#39;alimentazione e il passaggio in un formato a 96 pozzetti mentre anche consentendo efficiente scale-up. Un robot liquido gestione è stato utilizzato per alimentare regolarmente le colonie IPSC e li passo a intervalli regolari da dissociazione enzimatica. Il robot è stato anche programmato per produrre lastre rivestite gel matrice extracellulare ed eseguire un gradiente di densità di semina. Quando fibroblasti e adiposo derivato iPSCs sono stati coltivati ​​in questo sistema per più di 20 passaggi, circa 3 mesi, pluripotenza è stata mantenuta, così come lo erano cariotipo stabili. Entrambe le linee di cellule erano in grado di differenziazione in cardiomiociti. Insieme, la collezione di protocolli qui descritta consente agli utenti con poca esperienza sulle cellule staminali cultura o accesso limitato alle attrezzature cultura specialistica, alle cellule staminali di coltura e di raggiungere una produzione di cellule o la manipolazione con il lavoro minimo e il costo su più righe. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; I protocolli robotici qui descritti forniscono un metodo per scale-up economico di produzione e nel trattamento IPSC. Un vantaggio è la cultura di cellule staminali e scalabile in un formato basato su piastra stabilito dimostrato qui e in precedenza 44,47 - 49 per mantenere la pluripotenza. Mentre gli altri formati di cellule pluripotenti scalabile di cellule staminali cultura rendimento 20,23,29 metodo basato questo piatto richiede essenzialmente nessun cambiamento nella disposizione della cultura, come adattamento alla sospensione, l&#39;uso di sostanze chimiche o antischiuma uso prolungato di Rho-chinasi inibitori 20. Questo metodo della piastra base può quindi rapidamente, e prevedibilmente, accogliere nuove linee in quanto le condizioni di coltura sono simili. Come l&#39;uso di iPSCs per la modellazione della malattia aumenta 4,6,19,50, nuove linee IPSC sono continuamente generate. Le tecniche qui descritte sono più adatti alla cultura nuova linee in medio-alto volume e la velocità perché la barriera di transizione sul formato è low. Questo è vero per la manodopera e apparecchiature necessarie per mantenere le colonie anche. Infine, perché il formato e la manipolazione sono simili per l&#39;ambiente utilizzata per ricavare e validare linee IPSC, le prestazioni della cultura, come la differenziazione diretta, è probabile che sia più prevedibile. La figura 8 illustra una strategia per scale up della produzione di cellule staminali in piastre da 96 pozzetti. Una piastra (Ciclo 0) è utilizzata per seminare robot 12 nuovi piatti, un aumento di 12 volte (Ciclo 0 a 1). Dopo diversi giorni di alimentazione, uno dei dodici piastre è diversi passaggi per seminare un&#39;altra serie di dodici piastre (ciclo 1 al ciclo 2). I rimanenti piastre undici sono ora disponibili per altri usi e rappresentano la componente produzione del sistema. A questo ritmo, il passaggio di una piastra fornirà 11 piatti ogni ciclo, o ogni 3-4 giorni. Questa metodologia può essere scalata maggiore quando più piastre sono diversi passaggi, come illustrato nel passaggio dal Ciclo 2 Ciclo 3. In Ciclo 3, due piastre sonosempre utilizzato per mantenere la colonia e delle sementi 24 nuovi piatti. I restanti 22 piastre sono quindi disponibili per l&#39;uso dopo ogni ciclo di passaggio. In qualsiasi punto del ciclo di manutenzione l&#39;utente può seminare più piastre per aumentare la produzione. Un esempio potrebbe essere quello di passaggio ogni colonna per due cicli di crescita. Il primo passaggio converte una piastra in dodici piastre, e ciascuno dei dodici piastre viene utilizzata per seminare 144 piastre. In questo caso, un utente inizia con una piastra e dopo due passaggi, o circa 1,5-2 settimane di coltura, di 144 piastre. Ad esempio, i fibroblasti e adipose linee IPSC producono circa 25-75.000.000 cellule per piastra a 96 pozzetti quando si è pronti per il passaggio. 144 piastre potrebbero quindi rappresentare circa 4-7 x 10 9 cellule. Qual è il peso del lavoro per la realizzazione di 144 piastre da 96 pozzetti robot? Uno degli obiettivi di questo lavoro è stata la produzione scalabile di cellule staminali che ha ridotto il lavoro rispetto ai tradizionali (targa ad esempio, 6 pozzetti) staminali coltura cellulare. Il robot accomplishes questo per alleviare la necessità di gestire fisicamente ogni piatto durante l&#39;alimentazione e passaging. Mentre a 96 pozzetti scale di produzione piatto linearmente come sarebbe in 6 pozzetti tradizionali, il tempo di un tecnico passa a lavorare con i piatti è molto meno con la cultura robotica. L&#39;efficienza di produzione della cultura robotica deriva da questa differenza (Figura 9). E &#39;stato trovato i tecnici hanno potuto rimuovere un 6-pozzetti dal termostato, controllare sul microscopio, poi aspirare e alimentare il piatto in circa 3,5 minuti. In confronto, i tecnici spendono circa 30 sec rimuovendo una piastra a 96 pozzetti da incubatore e ispezionandolo sul microscopio per la densità e la contaminazione prima dell&#39;immissione sul robot. Con un protocollo alimentazione espanso simile a quella sopra descritta, sei piastre a 96 pozzetti possono essere caricati e alimentati, che dura circa 21 min, o 3,5 min per piastra. Il tempo trascorso totale per alimentare un piatto è comparabile tra robotè richiesto ic e metodi manuali, ma per alimentazione mano 6 piatti di un tecnico per tutti i 21 minuti, mentre il tecnico spende gestire i sei piatti per il robot (un controllo 30 sec per piastra) a soli 3 minuti. Come mostra la figura 9 mostra, il tempo trascorre un tecnico movimentazione 144 piastre utilizzando il robot è di circa 1,2 ore, rispetto all&#39;8 hr manualmente il robot farà mai gestire un errore piastre o il trasferimento di liquidi. Le 96 pozzetti IPSC metodi di coltura qui descritti forniscono una piattaforma per le attività di screening trattabili complesse. Poiché ogni bene è geneticamente identici e testa di serie alla stessa densità dallo stesso pool iniziale, le variabili possono essere distribuiti in tutta la piastra e mantenuti dal robot con serbatoi disponibili in commercio per separare condizioni. Questo sarebbe utile per esperimenti come la crescita delle cellule staminali dei media sviluppo 34,35,47, substrato o condizione cultura test e studi di tossicità che utilizzano cellule staminali51. Dal momento che ogni linea di cellule staminali è unica in termini di requisiti ottimali dimensioni delle colonie e di passaggio, si può usare questo sistema per modulare la densità di semina, la frequenza di alimentazione e la manipolazione passaggio manipolando le colonne raccolte, l&#39;agitazione meccanica durante il passaggio e la frequenza di alimentazione. Iterazione attraverso queste variabili permette all&#39;utente di trovare rapidamente una serie di condizioni idonee per la cultura di una nuova linea o sviluppare nuove tecniche di coltura. Il sistema robotico è anche in grado di mantenere 96 colonie di cellule staminali parallele ma indipendenti. Quando IPSC sono derivati ​​da cellule somatiche o clonato dopo la manipolazione genetica, molti cloni paralleli sono proiettati per produrre potenziali linee IPSC. Una volta che le singole cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti, il sistema può alimentare e di passaggio le piastre a 96 pozzetti mantenendo ogni colonia segregata. Ciò consente molto elevato throughput quando si seleziona potenziali cloni ed elimina la difficoltà di coltura fisicamente 96 linee parallele. Questo metodo inoltrellows scalati produzione di ogni clone in modo che il materiale è facilmente disponibile per l&#39;analisi in parallelo. Infine, prevediamo integrando tali tecniche di coltura con un sistema di traffico piatto robotico che trasporta piastre da e per l&#39;incubatore abilitazione coltura completamente automatizzato. Ciò potrebbe essere realizzato con più robotica complessi che consentono una maggiore espansione poiché i protocolli di base qui descritte sono trasferibili ad altri sistemi basati piastra. I primi passi fondamentali per affrontare nei protocolli sono quelli che impediscono e controllano per la contaminazione, come passi 1.5 e 4.2. Contaminazione, come discusso in precedenza, può essere evitato con successo se buona tecnica sterile e il buon senso sono utilizzati. E &#39;indispensabile, indipendentemente dal formato coltura di cellule staminali, che il controllo dell&#39;operatore di contaminazione e di farlo in questo protocollo i passi indicati ridurrà notevolmente il rischio di contaminazione. La corretta applicazione del gel matrice extracellulare è un secondo esspasso ziale per il successo globale di questo protocollo. Senza rivestimento adeguatamente le piastre a 96 pozzetti, le cellule staminali non crescerà. Un problema comune è il rivestimento ben incompleta. L&#39;esperienza ha dimostrato che le bolle d&#39;aria, attrazione elettrostatica e capillarità ostacolano rivestimento ben completa. La fase di pre-bagnatura (1.6) è stato sviluppato per migliorare significativamente il rivestimento ben inferiore e non deve essere ignorato. Questa fase di pre-bagnatura sembra ridurre l&#39;apparente idrofobicità della piastra a 96 pozzetti di plastica in modo che quando il rivestimento in gel matrice extracellulare viene applicato è uniformemente distribuito attraverso il ben inferiore e lati. Si raccomanda inoltre di toccare delicatamente le piastre a 96 pozzetti contro una mano pulita una volta rivestito per assicurare una distribuzione soluzione di gel matrice extracellulare anche. I parametri di dissociazione sono importanti anche per ottimizzare. Incubazione estesa con l&#39;enzima o il reagente di dissociazione base EDTA si tradurrà in singole cellule che possono o non possono essere l&#39;obiettivo durante il passaggio. Pertanto, l&#39;operatoredovrebbe prestare particolare attenzione a come il tempo di dissociazione, forza triturazione, e le ripetizioni di lavaggio influenzano la morfologia delle colonie e la salute e regolare di conseguenza. Comprendere i limiti alle tecniche qui descritte sono di fondamentale importanza per il funzionamento di successo. Come in qualsiasi altra impostazione coltura cellulare, l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti presenta un rischio relativamente alto di contaminazione. Come sopra descritto, un tecnico è gestire ogni piastra durante l&#39;alimentazione e passaging; per esempio, quando si apre il coperchio, mettere la piastra sulla base del robot, e controllando la piastra sul microscopio. Quindi, come indicato dopo passo 1.5, è imperativo non toccare la parte interna del coperchio qualsiasi piatto o esporre questa parte a qualsiasi superficie potenzialmente contaminati, come i blocchi riscaldanti inclinate o perni verticali sul letto. Durante lo sviluppo del protocollo questa limitazione è stato scoperto e ha dato l&#39;impulso per sviluppare un rack per contenere coperchi piastra per mantenere la sterilità. Allo stesso modo, i serbatoi di valle, puntali e other forniture sul liquido letto manipolazione robot sono potenziali fonti di contaminazione, perché sono aperti per l&#39;ambiente e la manipolazione da parte del tecnico. Pertanto, buona tecnica sterile deve essere applicato come la riduzione dei movimenti rispetto ai materiali della cultura esposti o liquidi aperti. Un altro limite è che quando il protocollo è calcificato, controllando visivamente ogni ben di&gt; 100 piastre a 96 pozzetti è ingombrante. Questo può essere affrontato da ispezionare visivamente tutta la piastra per i segni di contaminazione, come i media torbido, per identificare i pozzi sospetti. Per future scala up, verrà incorporata uso di un microscopio automatico e indicatore della crescita cellulare e la potenziale contaminazione. In sintesi, l&#39;high-throughput da 96 pozzetti piattaforma basata descritto qui offre un metodo fedeltà riproducibili, alto per la cultura e la produzione di cellule staminali in un formato piatto. Questo metodo riduce l&#39;esperienza richiesta, delle attrezzature necessarie e di lavoro dedicata per arginare coltura cellulare mentremantenendo i vantaggi di cultura tradizionale aderente.

L&#39;uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) è aumentato in modo significativo dal loro derivazione nel 2007 1 per il test composto, medicina rigenerativa e modellazione malattia 2-6. Questa richiesta viene dalla capacità di IPSC per produrre un gran numero di cellule pluripotenti che possono essere differenziate in cellule somatiche in una quantità senza precedenti. Poiché le tecniche di differenziazione dirette migliorano 7-10 e lo sviluppo di cellule umane o di modellazione dei tessuti e terapia cellulare aumenta 11-14, così fa la richiesta di produzione di massa di iPSCs di alta qualità. E &#39;ampiamente citato che tra le altre malattie, l&#39;infarto miocardico o la sostituzione funzionale b-cellule richiederanno centinaia di milioni di miliardi di IPSC derivate cellule somatiche 15 - 18. Modellazione 3D dei tessuti, inoltre, sempre più complesso per la scoperta di farmaci e therapy chiederemo gran numero di cellule 9,13,19. In tutti questi esempi, definiti, uniforme e iPSCs riproducibili devono essere disponibili e semplice da produrre. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. La produzione in scala di iPSCs si è concentrata sulla coltura in sospensione 20 - 25 o sospensione con l&#39;utilizzo di substrati microcarrier 26-28 anche perché queste tecniche vengono distribuiti con successo su larga scala, non IPSC, produzione con sede eucarioti. Diversi gruppi hanno dimostrato sistemi di coltura sospensione che producono cellule staminali pluripotenti 20,21,23,24,29. Tuttavia, questi approcci utilizzano sistemi costosi e complessi non immediatamente disponibili ai ricercatori in via di sviluppo programmi di differenziazione romanzo, guidando l&#39;ingegneria dei tessuti e facendo laboratricerca ory scala. Inoltre, sospensione e microcarrier IPSC culture richiedono un adeguamento e di tecniche o prodotti chimici che non si trovano in cultura tradizionale aderente iPSC come l&#39;uso continuo di inibitore di Rho-chinasi, agenti antischiuma e filtrazione per regolare aggregazione. Lo stress fisico alle cellule è più prevalente in coltura in sospensione, introdotto mediante agitazione meccanica e durante microcarrier collisione. Questi problemi limitano la prevedibilità e la velocità con cui appena generato linee di cellule staminali possono essere coltivate in sospensione. Altri hanno sviluppato sistemi di movimentazione piastra robotici che imitano piastra tecniche di coltura 30,31 ma queste piattaforme richiedono significativi investimenti per attrezzature e competenze per operare in aggiunta alle sfide fondamentali associati alla cultura di cellule staminali. Il seguente lavoro descrive lo sviluppo e la pratica di una soluzione scalabile sistema di coltura IPSC che utilizza un liquido robotica 8 canali standard di self-containedpiastre gestore e 96 pozzetti. Questo metodo è stato progettato per colmare scala di laboratorio cultura IPSC e ad alto volume di produzione IPSC (ad esempio, 10 7-1,5 x 10 9 cellule per settimana a tecnico) che permettono quelle sviluppo di nuove tecnologie IPSC di scalare facilmente la produzione senza grandi investimenti hardware o di lavoro. Questo metodo è relativamente poco costoso da installare, richiede poco o nessun coltura di cellule staminali, programmazione o ingegneria esperienza, ha un ingombro apparecchiatura senza la necessità di una cappa di coltura cellulare dedicato, e utilizza attrezzature di coltura cellulare standard per consentire medio ad alto rendimento automatizzato la produzione di cellule. L&#39;obiettivo era quello di sviluppare un sistema in grado di coltura di cellule staminali scalabile che può essere utilizzato da laboratori nuovi per arginare coltura cellulare, coloro che trovano la coltivazione manuale una barriera per sviluppare le proprie idee o coloro che desiderano un mezzo economico per la produzione di un gran numero di cellule staminali. La piattaforma presentata qui rimuove influenza tecnico sustaminali coltura cellulare e normalizza le modalità di alimentazione e di passaggio per consentire la produzione di cellule staminali coerente.

<table><tbody><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-well; Well volume: 360&amp;nbsp;&amp;#956;l; Cell growth area: 0.32&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;; Individually wrapped</td></tr><tr><td>Seahorse Trough</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 racks gilson 96 tips D200 tips</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&amp;nbsp; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td></tr><tr><td>Growth Factor Reduced Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Referred to as, &quot;extracellular matrix gel&quot; in the text. Matrigel GFR, 10&amp;nbsp;ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>Referred to as, &quot;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&quot; in the text. Accutase 500&amp;nbsp;ml sterile cell solution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&amp;nbsp;ml, 6/pk</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Avanzamento continua in coltura di cellule staminali pluripotenti sta chiudendo il gap tra panchina e comodino per l&#39;utilizzo di queste cellule nella medicina rigenerativa, scoperta di nuovi farmaci e test di sicurezza. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. Manutenzione di pluripotenza e prestazioni stabili delle cellule in applicazioni a valle (ad esempio, la differenziazione cellulare) nel tempo è fondamentale per la produzione di cellule su larga scala. Tuttavia che può essere difficile da raggiungere, soprattutto se le cellule sono coltivate manualmente quando l&#39;operatore può introdurre una significativa variabilità così come essere proibitivo in scala-up. Per abilitare high-throughput, su larga scala la produzione di cellule staminali e rimuovere l&#39;influenza dell&#39;operatore protocolli di coltura cellulare romanzo staminali utilizzando un banco multicanale movimentazione robot liquido sono stati sviluppati che richiedono il coinvolgimento tecnico minima o esperienza. Conqueste cellule staminali pluripotenti indotte umane protocolli (iPSCs) sono state coltivate in condizioni di assenza di alimentazione direttamente da un magazzino congelati e conservati in piastre da 96 pozzetti. A seconda linea cellulare e tasso scale-up desiderato, l&#39;operatore può facilmente determinare quando il passaggio sulla base di una serie di immagini che mostrano le densità colonia ottimali per spaccare. Poi i reagenti necessari sono pronti per eseguire una colonia divisione di nuove piastre senza una fase di centrifugazione. Dopo 20 passaggi (~ 3 mesi), due linee IPSC mantenuto cariotipi stabili, hanno espresso marcatori di cellule staminali, e differenziate in cardiomiociti ad alta efficienza. Il sistema può effettuare la successiva high-throughput screening di nuovi protocolli di differenziazione o la manipolazione genetica progettati per piastre a 96 pozzetti. Questa tecnologia consentirà di ridurre il carico di lavoro e tecniche per la produzione di un gran numero di cellule staminali identiche per una miriade di applicazioni.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

scalable-96-well-plate-based-ipsc-culture-production-using-robotic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

31.5K Views.  InvivoSciences, Inc.. The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes. 

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Ricerca

Genetica

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Bioingegneria

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Biologia

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Differenziazione indotta di cellule staminali pluripotenti mediante un sistema di coltura automatizzato

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Autore in primo piano: Automazione della coltura iPSC per una maggiore riproducibilità 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Biologia dello sviluppo

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Produzione robotica di Cancer Cell Spheroids con un sistema acquoso bifase per Drug Testing

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

Una piattaforma Microfluidic per l'isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Metodo per il pregiudizio elasticizzato ad alta velocità dell'essere umano ha indotto i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti in un formato a 96 pozzetti