Ringraziamo Anne de Jong e Sigieri Holsappel aiuto per la produzione slitta DNA microarray. Il supporto di Anne de Jong per l&#39;analisi bioinformatica è anche apprezzato. Ringraziamo anche Jelle Slager per la revisione della carta. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor sono supportati dall&#39;Università GC, Faisalabad, Pakistan nell&#39;ambito del programma di sviluppo della facoltà di HEC Pakistan.

1. Preparazione di Media e Cultura cellulare <ol><li> Grow S. pneumoniae D39 ceppo selvatico 21 come descritto in precedenza 11. Inoculare cellule stoccati a -80 ° C in 10% glicerolo (con rapporto di 1/100 in 50 ml provette sterili) in 50 ml chimica definita Medium (CDM) con un pH finale di 6,4 15, ma omettere L-serina dal amminoacido miscela. Nota: sono stati utilizzati due diversi CDM; uno contenente una concentrazione minima di L-serina (150 mM) e l&#39;altra contenente una concentrazione massima di L-serina (10 mM). Questa concentrazione minima è fondamentalmente la concentrazione di L-serina nel plasma del sangue umano e l&#39;obiettivo è quello di confrontare l&#39;espressione genica di S. pneumoniae ceppo D39 in queste due condizioni. </li></ol> 2. Isolamento di RNA totale <ol><li> Materiale <ol><li> Utilizzare fenolo acido, grado RNA per l&#39;isolamento di RNA totale. </li><li> Macaloid: <ol><li> Sospendere 2 grammi dimacaloid in 100 ml TE e far bollire per 5 min. Raffreddare a RT e sonicare fino macaloid gels.Centrifuge la soluzione a 2.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, risospendere in 50 ml TE pH 8 e conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Soluzioni: <ol><li> Trattare tutte le soluzioni con etere pirocarbonato (DEPC). Aggiungere 100 microlitri DEPC / 100 ml di soluzione, incubare O / N a 37 ° C e autoclave per 15 min. </li></ol></li></ol></li><li> Metodologia <ol><li> Crescere 50 ml di S. coltura cellulare pneumoniae D39 in 50 ml provette a 37 ° C (senza scuotimento) fino a metà fase esponenziale (OD ~ 0,3). Culture centrifugare a 4 ° C su 10.000 × g per 2 minuti. Eliminare i media e congelare immediatamente il pellet di cellule in azoto liquido. </li><li> Premix 300 ml di cloroformio: IAA (24: 1) e 300 ml di fenolo (fenolo acido, grado RNA). Utilizzare 500 microlitri della fase organica nel passaggio 2.2.3. </li><li> Preparare la seguente miscela in anticipo in tubi con tappo a vite senza RNA: 0.5 G perle di vetro, 50 ml 10% SDS, 500 microlitri fenolo / cloroformio: IAA (come preparato al punto 2.2.2), strato macaloid (150-175 ml, non è esatto in quanto è molto viscoso). Risospendere il pellet di cellule in 400 microlitri TE (DEPC) e aggiungere le cellule risospese nei tubi con tappo a vite. </li><li> Per rompere le cellule, posizionare i tubi con tappo a vite in un battitore tallone per impulsi 2x 60 &quot;(&#39;omogeneizzare&#39;) con 1 min intervallo in ghiaccio. Centrifugare i campioni per 10 min a 10.000 xg (4 ° C). </li><li> Trasferire la fase superiore in una nuova provetta, aggiungere 500 microlitri di cloroformio: IAA (24: 1) e centrifugare per 5 min a 10.000 xg (4 ° C). </li><li> Trasferire 500 microlitri della fase superiore ai tubi freschi, aggiungere 2 volumi (1 ml) di lisi / tampone di legame e mescolare pipettando su e giù. Isolare RNA totale utilizzando il kit di isolamento dell&#39;RNA e seguire il produttore protocollo raccomandato. </li></ol></li></ol> 3. RNA Cleanup &lt;<html> ol&gt; <li> Per rimuovere la contaminazione del DNA da RNA totale, aggiungere 100 microlitri mix DNAseI (buffer DNAse 90 microlitri e 10μl DNAseI) e incubare per 20-30 minuti a 15-25 ºC. </li><li> Lavare pulito RNA utilizzando il kit RNAse. Ottenere 50 ml di volume di eluizione. </li></ol> 4. Analisi di RNA <ol><li> Determinare la concentrazione di RNA su uno spettrofotometro. Determinare la qualità di RNA utilizzando un test come segue (Figura 2). <ol><li> Diluire 1 ml di campione con 50 ml di acqua DEPC per ottenere una concentrazione di 20-200 ng / ml. </li><li> Usare 1 ml campione di RNA diluito per verificare la qualità sulla Bioanalyser secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Nota: un rapporto di 23S: 16S di circa 2.0 è considerata buona unità 1 A260 RNA corrispondente a 40 mg / ml.. Una quantità raccomandata per l&#39;etichettatura è 10-20 mg. </li></ol> 5. cDNA Preparazione ed etichettatura S copi &quot;&gt; NOTA: Il seguente protocollo è stato seguito per la preparazione e l&#39;etichettatura cDNA. <ol><li> Ricottura <ol><li> Eseguire reazione ricottura in 300 provette PCR microlitri, mantenendo la concentrazione di RNA totale 10-15 mg per diapositive fatti in casa o 5 mg per le diapositive made-aziendali. Mescolare RNA con 2 nonamers microlitri casuali (1,6 mg / mL) e aggiungere acqua priva di nucleasi se necessario, per mantenere il volume finale della miscela ricottura a 18 ml. </li><li> Mantenere la miscela annealing a 70 ° C per 5 min. Dopo di che, raffreddare la miscela a temperatura ambiente per 10 min (annealing) e, se necessario, centrifugare le reazioni al fondo della provetta. Mettere le provette di reazione in ghiaccio per almeno 1 min. </li></ol></li><li> Trascrizione inversa <ol><li> Preparare il mix trascrittasi inversa come segue: a 18 microlitri mix ricottura, aggiungere 12 ml mix Master (composto da 6 microlitri di buffer 5x First Strand, 3 ml 0.1 M DDT, 1,2 ml 25x AA-dUTP / nucleotide mix e 1,8 microlitri inversione transcriptase (1 ml per le diapositive made-aziendali). Tenere il mix di reazione per 2-16 ore a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 6. Degrado di mRNA e Purificazione di cDNA <ol><li> Per degradare il mRNA dalla miscela di reazione, aggiungere 3 ml di 2,5 M NaOH e posto a 37 ° C per circa 15 min. Successivamente, aggiungere 15 ml di 2M Hepes acido libero per neutralizzare il NaOH. </li><li> Purificare la miscela cDNA utilizzando PCR colonne clean-up e seguire il protocollo del produttore. </li></ol> 7. Misura di cDNA Concentrazione <ol><li> Misurare le concentrazioni di cDNA su uno spettrofotometro. Per continuare con l&#39;etichettatura, verificare che la concentrazione di cDNA è di almeno 60 ng / ml (slides fatte in casa) o 20 ng / ml (slides made-aziendali). </li></ol> 8. Etichettatura del cDNA con Amine-reattiva Dye e Purificazione <ol><li> Utilizzare ammina reattiva tintura per etichettare il cDNA. Direttamente mescolare il cDNA con un&#39;aliquota (5 ml) diammina-reattiva tintura. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente, al buio, per 60 a 90 minuti e procedere direttamente alla purificazione di colorante marcato cDNA. Purificare cDNA dye-marcato utilizzando PCR colonne clean-up e seguendo il protocollo del produttore. Eluire cDNA in 50 ml di tampone di eluizione. </li></ol> 9. Misura di Labelled cDNA <ol><li> Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l&#39;incorporazione di coloranti ammina reattiva nel cDNA. Verificare che la concentrazione di coloranti ammina reattiva è almeno 0,5 pmol / ml in un volume totale di 50 microlitri. </li></ol> 10. La miscelazione di Labelled cDNA Campioni <ol><li> Per scivoli fatti in casa, utilizzare tutto il cDNA marcato per l&#39;ibridazione con la differenza di non più del 30% della concentrazione di cDNA. Per diapositive made-aziendali, utilizzare cDNA con non più di 2 volte differenza di concentrazione cDNA. Nota: normalmente, è necessaria circa 300 ng di cDNA per le diapositive made-società, che è molto poco rispetto al reqquantità di cDNA uired per diapositive fatti in casa. </li></ol> 11. ibridazione e di lavaggio <ol><li> Utilizzare i seguenti reagenti: acqua demineralizzata, etanolo 99%, TIMIDO Buffer (fatta in casa, con 40 microlitri lievito RNA). Preparare massimo 1 ml di SHY. </li><li> Apparecchiatura e soluzioni di preparazione <ol><li> Accendere concentratori di vuoto e di riscaldamento di almeno 1 ora prima dell&#39;essiccazione. Accendere ibridazione del forno, con set point impostato alla temperatura di ibridazione corretta (per S. pneumoniae DNA microarray, utilizzare 45 ° C). Allo stesso modo, preriscaldare cassette ibridazione e forno per 30-60 minuti. </li><li> Preriscaldare tampone SHY a 68 ° C per almeno 30 minuti. </li></ol></li><li> Preparazione del campione (contrassegnato cDNA) <ol><li> Combinare uguali quantità di cDNAs etichettati (max differenza 30%). Essiccare il campione usando i concentratori sotto vuoto ad alta temperatura (circa 40 min.) Fino a che il volume è inferiore a 7 microlitri. </li></ol></li><li> Lifter-slip <ol><li> Utilizzare pulite sollevatore-scivola.Nota: ± 30 ml possono essere caricati sulla diapositiva. </li><li> Pulire il sollevatore-scivola con sapone, un sacco di acqua di rubinetto e il 100% di etanolo. Nota: scivola sollevatore sporchi danno fondo elevato. </li><li> Asciugare il sollevatore-scivola con pistola ad aria compressa per soffiare via le particelle di polvere. Posizionare un pulito sollevatore-scivolo sulla trasparenza con il rivestimento in teflon bianco ai lati rivolti verso il basso. </li></ol></li><li> L&#39;aggiunta di tampone di ibridazione (per l&#39;etichetta cDNA) <ol><li> Sciogliere i campioni essiccati colorante in 7 ml H 2 O e incubare a 94 ° C per 2 min. </li><li> Immediatamente, aggiungere 35 microlitri preriscaldato tampone SHY (68 ° C), mescolare delicatamente e girare alla massima velocità per 1 minuto per sbarazzarsi di precipitati. Preriscaldare la sonda a 68 ° C per circa 5 minuti fino a quando il carico. </li></ol></li><li> Slide-sollevatore-slip assemblaggio e preriscaldamento. <ol><li> Collocare il supporto per ibridazione di diapositive su un calore-blocco a 50 ° C. Collocare i vetrini microarray DNA con il sollevatore-scivolo sul supporto ibridazione diapositive riscaldata e priscaldare il vetrino con sollevatore-scivolo per un minuto. Eseguire i passi successivi il più rapidamente possibile. </li><li> Aggiungere 40 ml di destinazione campione alla fine della diapositiva. Consentire il passaggio del fluido tra le superfici di vetro con la forza capillare. Eseguire tutte pipettaggio lentamente e con attenzione. </li><li> Tenere i vetrini con sollevatore-slip orizzontale in ogni momento e muoversi lentamente per assicurarsi che il sollevatore antiscivolo non si mosse. </li><li> Prendere la cassetta ibridazione preriscaldata dal forno ibridazione e chiudere la macchina. Luogo filtro di carta imbevuto con 3 ml 2x SSC (citrato salina standard) nel cassetto ibridazione. </li><li> Posizionare delicatamente il supporto per diapositive ibridazione con scivoli nel cassetto ibridazione. Chiudere la cassetta ibridazione e mettere in forno di ibridazione di nuovo (per circa 16-18 ore). </li></ol></li><li> Lavaggio diapositive <ol><li> Preparare freschi di lavaggio-buffers I, II e III (750 ml per la fase di lavaggio). Per 500 ml di wash-buffer di I, usare 2 x SSC / 0.5% SDS. Per 500 ml di wash-appassionatoer II, utilizzare 1 x SSC / 0,25% SDS. Per 500 ml lavare-buffer III, utilizzare 1 x SSC / 0.1% SDS (optional) </li><li> Posizionare i lavatoi buffer a 30 ° C (per essere sicuri SDS è sciolto). </li><li> Immergere i vetrini più rapidamente possibile, ma molto lentamente, in un tubo Falcon riempito con 50 ml di tampone di lavaggio I finché il vetro poggia sul fondo conico del tubo. </li><li> Dopo pochi secondi, quando i lavandini sollevatore scivolamento sul fondo della provetta, estrarre il vetrino con le pinzette senza graffiare la matrice e mettono nel rack della stazione di lavaggio. Continuare con il lavaggio senza intervallo di tempo. </li><li> Lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer I (in una stazione di lavaggio). Dategli un secondo lavaggio per 20-30 minuti a 500 ml lavare-buffer II (in una stazione di lavaggio). Analogamente, lavare i vetrini per 5 min in 500 ml lavare-buffer III (opzionale) (in una stazione di lavaggio). </li><li> Asciugare le diapositive per 2 min a 2.000 giri. </li></ol></li></ol> 12. Microarray Analysis <ol><li> Scansione di immaginicon rispettive lunghezze d&#39;onda in scanner e salvarli in una cartella &quot;Giove Progetto&quot;. </li><li> Utilizzare software per analizzare i file scansionati inizialmente come descritto in precedenza 22. Dopo l&#39;esecuzione di questo software, selezionare la scheda &quot;Apri immagine&quot; per caricare il file di immagine rosso (-.550) come &quot;Red&quot; e file di immagine verde (-.635) come &quot;Green&quot;. Carica il file gal (.gal) con lista di array S. pneumoniae il file di immagine selezionando &quot;Load List Array&quot; scheda 22. Nota: questa lista di array composto da 48 reti, in ogni griglia c&#39;erano 16 righe e 15 colonne. Ogni posto in griglia rappresenta un singolo gene e informazioni posto compreso il nome del gene viene aggiunto attraverso un file di descrizione spot. I numeri piatte sono dati da sinistra a destra e dall&#39;alto verso il basso. </li><li> Dopo individuare accuratamente le griglie, selezionare la scheda &quot;Trova Array, Trova blocchi, Allinea Funzioni&quot; per allineare i punti. Dopo l&#39;allineamento di tutte le funzioni, analizzare l&#39;immagine selezionando l&#39;opzione &quot;Analisi&quot; tab. Creare un nuovo file con i risultati, istogramma e diagramma a dispersione. Salvare il file dalla scheda &quot;Salva risultati come&quot; come file .gpr per ulteriori analisi. </li><li> Eseguire un&#39;ulteriore normalizzazione e l&#39;elaborazione dei dati con sviluppato in-house software Microprep descritti 9. </li><li> Utilizzare repliche biologiche indipendenti per dati microarray DNA che sono dye-swap. Eseguire implementazione CyberT di una variante di t-test1 e calcolare i tassi di scoperta di falsi (FDR), come descritto 9. </li><li> Per geni differenzialmente espressi, prendere p &lt;0,001 e FDR &lt;0.05 come standard. </li><li> Carica DNA microarray dati sulla pagina di presentazione NCBI per ottenere un GEO (Gene Expression Omnibus) numero di accesso. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Descriviamo un protocollo di facile uso che può essere applicato per eseguire tutta l&#39;analisi trascrittoma di batteri. Il punto chiave su questa particolare tecnica è che la condizione in cui le cellule vengono raccolte varierà. Dopo la raccolta delle cellule e RNA isolamento, questa tecnica diventa uguale per tutti i tipi di campioni batterici e segue i passi esattamente uguali, pertanto, può essere applicato a qualsiasi tipo di coltura batterica. Il protocollo è molto semplice e conveniente e parte da isolame...

Lo studio di tutta la serie di mRNA abbondanza (trascrittoma) codificata dal genoma di un organismo unicellulare o una cellula eucariotica in un momento specifico o in una condizione specifica, tra cui sovraespressione del gene o knock-out, si chiama trascrittomica. Trascrittomica ci permette di osservare in che misura i geni sono espressi in una particolare condizione in un punto di tempo X e ci dà informazioni su come fortemente i geni sono espressi rispetto a un riferimento. Un microarray è un array bidimensionale su un supporto solido (solitamente un vetrino o silicio cella a film sottile) che può essere utilizzato per saggiare grandi quantità di materiale biologico utilizzando screening ad alto rendimento, e miniaturizzato, trasformazione multiplex e paralleli e rilevazione metodi. Microarrays sono disponibili in varie tipologie, tra cui DNA microarrays, microarrays della proteina, microarrays peptide, microarray di tessuti, microarrays dell&#39;anticorpo, microarrays cellulari e altri. Un DNA microarray èfondamentalmente un insieme di punti di DNA microscopici fissato ad una superficie solida, di solito vetro. DNA microarray sono utilizzati per misurare i livelli di espressione di un gene o di una serie di geni simultaneamente o di genotipizzare più regioni del genoma 2,3. Picomoli (10 -12 moli) di una sonda sono presenti all&#39;interno di ogni spot DNA che rappresenta una specifica sequenza di DNA, noto anche come reporter. Le molecole di mRNA etichettati dai campioni vengono chiamati gli «obiettivi». Fluorofori sono utilizzati per misurare ibridazione sonda-target e rivelazione di bersagli fluoroforo marcata determina la relativa abbondanza di sequenze di acido nucleico nel target. Un esperimento microarray può compiere più test genetici in parallelo perché un array può contenere decine di migliaia di sonde. Il layout di un esperimento microarray semplice è mostrato in figura 1. Recentemente, è stato stabilito nei nostri laboratori ed altri che queste matrici sono riutilizzabili, il che rende questa tecnica molto conveniente effective. Diverse tecniche di isolamento di RNA e di depurazione sono stati sviluppati nel corso degli anni, tra cui C-TAB, SDS e metodi GT 4-8. Inoltre, diversi kit commerciali sono inoltre disponibili. Per l&#39;espressione genica RNA di alta qualità è molto importante. Pertanto, i metodi di isolamento dell&#39;RNA vengono modificati per ottenere una quantità massima di RNA. Allo stesso modo, sono ridotti al minimo i passaggi per la preparazione cDNA e l&#39;etichettatura di cDNA. Normalizzazione dei dati dopo la scansione viene eseguita anche in modo efficiente utilizzando in-house costruita pacchetti e strumenti 9 software. Streptococcus pneumoniae è un patogeno umano Gram-positivi che colonizza il rinofaringe ed è la causa di infezioni multiple come la polmonite, la sepsi, otite media e la meningite 10. Il batterio può utilizzare un&#39;ampia varietà di nutrienti necessari per la crescita e la sopravvivenza 11,12. Numerosi studi sono stati effettuati sullametabolismo dell&#39;azoto pneumococco e regolazione sottolineando l&#39;importanza di aminoacidi e il loro ruolo nella virulenza 13,14. In questo studio, la risposta transcriptomic di S. pneumoniae alle mutevoli concentrazioni di L-serina, un acido abbondantemente presente nel plasma del sangue umano amino, è notificato mediante DNA microarray. La risposta trascrittomica di S. pneumoniae cresciuto in una concentrazione minima di L-serina (150 mM) è stato confrontato con quello coltivato in una concentrazione massima (10 mM) di serina. Mezzo chimicamente definito (CDM o terreno minimo) 15 è stato utilizzato per questo studio per controllare la concentrazione di serina. Il focus di questo studio è quello di rendere facile da usare questa tecnica e di fornire diversi strumenti per la normalizzazione e l&#39;analisi dei dati. Pertanto, una serie di strumenti sono stati sviluppati per l&#39;analisi e l&#39;interpretazione dei dati. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornisce una piattaforma per il trattamento delle informazioni contenute in gruppi di geni che hannomodelli di espressione genica simili e per la costruzione di profili funzionali 16. PROCURATORE è un altro pacchetto software che facilita l&#39;individuazione delle funzioni putativi e annotazioni di geni 17. Facendo uso di metodi di clustering, divulgare fornisce un algoritmo di rilevamento sito DNA di legame. Motivi Cis -regulatory di geni possono essere proiettati usando questo algoritmo 18. Genome2D offre una piattaforma basata su Windows per la visualizzazione e l&#39;analisi dei dati trascrittoma offrendo diverse gamme di colori per caratterizzare i cambiamenti nei livelli di espressione genica su una mappa del genoma 19. Il webserver Pepe offre, oltre al metodo di all-in-one di analisi, una serie di strumenti per l&#39;industria mineraria per regulons, promotori e fattore di trascrizione siti di legame di 20. Annotazione completa delle regioni intergeniche in un genoma batterico può essere ottenuto utilizzando questo pacchetto. I biologi possono trarre grandi vantaggi da pepe quanto offre loro una piattaforma per la progettazione dell&#39;esperimentos in modo che le informazioni ipotizzata può essere confermata in vitro 20. Questi pacchetti software contribuiscono in modo significativo all&#39;analisi microarray come la maggior parte di loro sono liberamente disponibili e rendere la normalizzazione dei dati e di analisi molto affidabile.

<table><tbody><tr><td>Acid phenol</td><td>SigmaAldrich</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Roche RNA isolation kit</td><td>Roche Applied Science</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td></td><td>105015</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Boom</td><td>92013505.1000.</td><td></td></tr><tr><td>IAA</td><td></td><td>106630</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>ND-100</td><td></td></tr><tr><td>Agilent BioAnalyser</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>AA-dUTP</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>AM8439</td><td></td></tr><tr><td>DDT</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>First Strand buffer</td><td>Life technologies Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>SigmaAldrich</td><td>S8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-550</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62262</td><td></td></tr><tr><td>DyLight-650</td><td>Thermoscientiffic</td><td>62265</td><td></td></tr><tr><td>SHY Buffer</td><td>SigmaAldrich</td><td>H7033-125ML</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac cooler</td><td>Eppendorf</td><td>RUGNE3140</td><td>Speedvac concentrator plus</td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Grant Boekel</td><td>Iso-20</td><td></td></tr><tr><td>Lifter-slips</td><td>Erie Scientific</td><td>25x60I-M-5439</td><td></td></tr><tr><td>Wipe</td><td>KIMTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SigmaAldrich</td><td>L3771-100g</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>SigmaAldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Genpix autoloader 4200A1</td><td>MSD analytical technologies</td><td></td><td>Microarray scanner</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>SigmaAldrich</td><td>104766</td><td></td></tr></tbody></table>

a fast and reliable pipeline for bacterial transcriptome analysis case study: serine-dependent gene regulation in streptococcus pneumoniae

Espressione genica e la sua regolazione sono molto importanti per capire il comportamento delle cellule in condizioni diverse. Varie tecniche sono usate oggi per studiare l&#39;espressione genica, ma la maggior parte sono limitati in termini di fornire una visione globale dell&#39;espressione dell&#39;intero trascrittoma. DNA microarrays offrire una tecnologia di ricerca rapida ed economica, che offre una panoramica completa di espressione genica globale e hanno un gran numero di applicazioni, tra cui l&#39;identificazione di nuovi geni e fattori di trascrizione siti, caratterizzazione delle attività trascrizionale di cellule e vincolante anche aiutare ad analizzare migliaia di geni (in un singolo esperimento). In questo studio, sono stati ottimizzati i presupposti per l&#39;analisi del trascrittoma batterica dalla raccolta delle cellule per l&#39;analisi del DNA microarray. Tenendo conto del tempo, i costi e la precisione degli esperimenti, la piattaforma tecnologica si rivela molto utile e universalmente applicabale per studiare transcripto battericames. Qui, eseguiamo analisi del DNA microarray con Streptococcus pneumoniae come caso-studio confrontando le risposte trascrizionali di S. pneumoniae coltivate in presenza di concentrazioni variabili L-serina nel terreno. RNA totale è stato isolato mediante un metodo Macaloid utilizzando un kit di isolamento di RNA e la qualità dell&#39;RNA è stata verificata utilizzando un kit di controllo qualità dell&#39;RNA. cDNA è stato redatto utilizzando trascrittasi inversa e campioni di cDNA sono stati etichettati utilizzando uno dei due coloranti fluorescenti ammine-reattiva. DNA microarray diapositive in casa sono stati utilizzati per l&#39;ibridazione dei campioni di cDNA etichettati e dati di microarray sono stati analizzati utilizzando un framework pre-elaborazione dei dati cDNA microarray (Microprep). Infine, Cyber-T è stato utilizzato per analizzare i dati generati utilizzando Microprep per l&#39;identificazione di statisticamente significative geni differenzialmente espressi. Pacchetti software, inoltre, costruito in-house (pepe, FIVA, divulgare, MINISTERO, Genome2D) sono stati utilizzati per analizzaredati.

RNA, isolamenti e analisi di cDNA L-serina è uno degli amminoacidi essenziali e la sua concentrazione nel plasma del sangue umano varia 60-150 mM in bambini e adulti. Il suo ruolo nella biosintesi delle purine e pirimidine sottolinea la sua importanza nel metabolismo ed è un precursore di diversi aminoacidi (glicina, cisteina e triptofano). Per studiare l&#39;effetto di L-serina nel complesso trascrittoma di S. pneumoniae D39 ceppo selvatico, analisi microarray de...

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A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un&#39;analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

a-fast-reliable-pipeline-for-bacterial-transcriptome-analysis-case

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

10.3K Views.  University of Groningen. This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages. 

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Ricerca

Genetica

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Immunologia e infezioni

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized notably due to the difficulty of identifying their mRNA targets. Here, we described a modified protocol of the MS2-Affinity Purification coupled with RNA Sequencing (MAPS) technology, aiming to reveal all RNA partners of a specific sRNA in vivo. Broadly, the MS2 aptamer is fused to the 5&#8217; extremity of the sRNA of interest. This construct is then expressed in vivo, allowing the MS2-sRNA to interact with its cellular partners. After bacterial harvesting, cells are mechanically lysed. The crude extract is loaded into an amylose-based chromatography column previously coated with the MS2 protein fused to the maltose binding protein. This enables the specific capture of MS2-sRNA and interacting RNAs. After elution, co-purified RNAs are identified by high-throughput RNA sequencing and subsequent bioinformatic analysis. The following protocol has been implemented in the Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus and is, in principle, transposable to any Gram-positive bacteria. To sum up, MAPS technology constitutes an efficient method to deeply explore the regulatory network of a particular sRNA, offering a snapshot of its whole targetome. However, it is important to keep in mind that putative targets identified by MAPS still need to be validated by complementary experimental approaches.

MAPS technology has been developed to scrutinize the targetome of a specific regulatory RNA in vivo. The sRNA of interest is tagged with a MS2 aptamer enabling the co-purification of its RNA partners and their identification by RNA sequencing. This modified protocol is particularly suited for Gram-positive bacteria.&#160;

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Biochimica

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Bioingegneria

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Biologia

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, studies in this serotype have been hindered by the lack of genetic tools to modify it. In this study, we describe a method to genetically modify a serotype 1 clinical isolate (strain 519/43). Interestingly, this was achieved by exploiting the Pneumococcus&#8217; ability to naturally acquire DNA. However, unlike most pneumococci, the use of linear DNA was not successful; to mutate this important strain, a suicide plasmid had to be used. This methodology has provided the means for a deeper understanding of this elusive serotype, both in terms of its biology and pathogenicity. To validate the method, the major known pneumococcal toxin, pneumolysin, was mutated because it has a well-known and easy to follow phenotype. We showed that the mutant, as expected, lost its ability to lyse red blood cells. By being able to mutate an important gene in the serotype of interest, we were able to observe different phenotypes for loss of function mutants upon intraperitoneal and intranasal infections from the ones observed for other serotypes. In summary, this study proves that strain 519/43 (serotype 1) can be genetically modified.

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Here, we describe a S. pneumoniae serotype 1 strain 519/43 that can be genetically modified by using its ability to naturally acquire DNA and a suicide-plasmid. As proof of principle, an isogenic mutant in the pneumolysin (ply) gene was made.

Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un'analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in

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RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di

Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali

Genome-wide gene delezioni in

Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression