Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH AI56168, AI71142, AI87541 e AI100631 di MDP. Maurizio Del Poeta è Burroughs Wellcome Investigator in Malattie Infettive.

1. Colesterolo esaurimento delle Cellule J774A.1 con MβCD <ol><li> In un armadio biosicurezza sterili, 10 5 J774A.1 macrofagi come seme per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% penicillina / streptomicina (P / S). Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 O / N. </li><li> Rimuovere i supporti dal monostrato cellulare e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS), che è stata filtrata o in autoclave. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione MβCD alla concentrazione desiderata (10 mM mM o 30 in PBS) o PBS 1x come controllo e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione. Rimuovere il surnatante e riserva a RT per l&#39;analisi quantitativa con kit disponibile in commercio subito dopo la procedura. </li><li> Lavare le cellule due o tre volte con PBS 1x o siero DMEM gratuito e continuare con infezione o lisi delle cellule di pipetting due o tre volte con H 2 O deionizzata per l&#39;analisi mediante cromatografia su strato sottile o con un kit. NOTA: Dopo colesterolo deplezione un kit disponibile in commercio colesterolo quantificazione può essere utilizzato. Vedere la sezione Materiali per i dettagli. Seguire le istruzioni del produttore come scritto. </li></ol> 2. Osservazione di colesterolo contenuti da cromatografia su strato sottile (TLC) <ol><li> Lavare un serbatoio TLC due volte con acetone e una volta con una soluzione di etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume). Saturare il serbatoio con l&#39;etere di petrolio: etere dietilico: acido acetico (65: 30: 1 in volume) e lasciare soluzione O / N. NOTA: Organic solventi devono essere utilizzati sotto una cappa per evitare l&#39;inalazione di vapori. Guanti e camice da laboratorio devono essere indossati in ogni momento. L&#39;acido acetico è un acido forte e deve essere usato con cautela. </li><li> In un armadio biosicurezza sterile, seme 10 6 J774A.1 i macrofagi per bene su un ce 6-benell piastra di coltura in un volume di 5 ml di DMEM calda supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4, sostituendo 1 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi. </li><li> Aggiungere 500 ml di tripsina-EDTA ad ogni pozzetto, incubare per 3 minuti a 37 ° C, e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. </li><li> Trasferire in una provetta per microcentrifuga e aggiungere ulteriori 500 ml di DMEM caldo supplementato con 10% FBS e 1% P / S. </li><li> Spin le cellule per 5 minuti a 300 xg e rimuovere il surnatante. </li><li> Aggiungere altri 500 ml di DMEM supplementato con calda 10% FBS e 1% P / S al pellet e risospendere accuratamente pipettando su e giù. </li><li> Rimuovere 10 ml di cellule e contare le cellule su un emocitometro. Normalizzare la concentrazione cellulare di ciascun campione e aggiungere un numero uguale di cellule di tubi di vetro. NOTA: A questo punto, si puòscegliere di combinare cellule dagli stessi gruppi di trattamento per ottenere un estratto lipidico finale più concentrato. </li><li> Cellule centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere i supporti. </li><li> Aggiungere 2 ml di metanolo e vortex. Quindi, aggiungere 1 ml di cloroformio e vortex. Controllare lo stato di fase per assicurarsi che la soluzione in monofasica. NOTA: tubi può essere conservato a 4 ° CO / N. </li><li> Centrifugare a 1700 xg per 10 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta </li><li> Aggiungere un ulteriore 1 ml di cloroformio seguita da 1 ml di dH 2 O. Vortex due volte per 30 sec. Centrifugare a 1700 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Pesare un tubo di vetro ad una bilancia sensibile e utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per trasferire la fase inferiore nel tubo di vetro del peso noto. </li><li> Asciugare giù lipidi in un evaporatore centrifuga fino a secco (circa 2 ore). Pesare tubo con lipidi secchi e calcolare il peso a secco di lipidi. NOTA: lipidi secco può essere memorizzato in -20 ° C fino al momento di effettuare TLC. </li><li> Diluire lipidi essiccati in cloroformio sufficiente per normalizzare la concentrazione di lipidi (di solito 20 - 50 microlitri) e 20 microlitri di carico del lipide diluito su una piastra di TLC silice. Carico 20 mg di colesterolo diluito in 20 ml di cloroformio come standard. </li><li> Aggiungere piastra TLC essiccato al serbatoio TLC saturi e consentire solvente migrare fino a 1 cm prima piastra di bordo. Rimuovere la piastra TLC dal serbatoio e lasciarlo asciugare circa 5 min. </li><li> Visualizza lipidi mettendo in un serbatoio vapori di iodio per controllare la migrazione. Rimuovere e consentono punti di dissolvenza per circa 10 - 15 minuti sotto il cofano. NOTA: Lo iodio è un pericolo per inalazione. Utilizzare sempre sotto una cappa aspirante. </li><li> Preparare una soluzione per la colorazione lipidi neutri combinando 60 ml di metanolo con 60 ml di H 2 O deionizzata, 4 ml di acido solforico, e 630 mg di cloruro di manganese. </li><li> Lentamente e con cautela immergere la piastra TLC nella soluzione lipidica colorazione neutra in un vassoio e rimuovere senza desquamazione della silice layer. NOTA: La soluzione lipidica colorazione neutra può essere riutilizzato più volte e in modo che possa essere recuperato dal vassoio e rimesso in una bottiglia per un uso successivo. </li><li> Lasciare piastra asciugare sotto il cofano a RT finché è scomparsa tutte le bolle. Riscaldare la piastra TLC su un set blocco termico a 160 ° C e char al colore desiderato. NOTA: Un programma densitometria come Vision Lavori LS può essere utilizzato per quantificare le bande carbonizzati per confrontare i campioni di lipidi. </li></ol> 3. L&#39;infezione dei macrofagi con C. neoformans (H99) <ol><li> In un armadio biosicurezza sterili, semi di 10 celle 5 macrofagi come per bene su una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti in 200 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. NOTA: L&#39;infezione può essere effettuata anche in fondo di vetro piatti confocale per l&#39;imaging più facile; tutti gli importi rimangono gli stessi. </li><li> Crescere una cultura di C. neoformans (H99)inoculando 10 ml di YNB con una colonia ottenuto da una piastra colpito e incubando è O / N a 30 ° C con agitazione. </li><li> Lavare e contare C. neoformans (H99), le cellule. <ol><li> Centrifuga C. cultura neoformans O / N a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supporto e scartare. Lavare le cellule con 5 ml di 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere PBS e lavare con 5 ml di filtrato 1x PBS. Centrifugare a 1.700 xg per 10 min a 4 ° C. Ripetere questa operazione altre 2 volte. </li><li> Rimuovere PBS e risospendere in 5 ml di 1x PBS. </li><li> Fare diluizioni seriali in PBS per ottenere una diluizione 1: 500 della cultura lavato. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri del campione originale 900 microlitri di PBS 1x per ottenere una diluizione 1:10. </li><li> Aggiungere 100 ml di 01:10 campione diluito a 900 ml di 1x PBS per ottenere una diluizione 1: 100. </li><li> Aggiungere 200 ml di 1: campione diluito 100 a 800 ml di PBS 1x per ottenere un 1: 500 dilutisu </li></ol></li><li> Prendere 10 ml di diluizione 1: 500 e contare su emocitometro per calcolare il numero di cellule. </li></ol></li><li> Preparare soluzione di lavoro per l&#39;attivazione dei macrofagi e opsonizzare C. neoformans. <ol><li> Diluire LPS e IFNγ 100x di soluzioni di riserva con l&#39;aggiunta di 10 ml a 990 ml. NOTA: LPS e IFNγ vengono utilizzati per migliorare l&#39;assorbimento dei fagociti, ma non sono necessari per la fagocitosi. Se c&#39;è un interesse per l&#39;attività fungicida dei macrofagi, effettuare l&#39;attivazione O / N a 37 ° C con agitazione prima dell&#39;infezione. </li><li> Per esempio combinano 7,5 ml di LPS diluito, 1,25 ml di IFNγ diluita, 1,25 ml di anticorpi GXM e il volume del C. cultura neoformans che dà 1,25 x 10 5 cellule. Portare il volume fino a 250 ml, moltiplicato per il numero di campioni con DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S. </li><li> Vortex e incubare soluzione per 20 minuti a 37 ° C con agitazione. NOTA:Colesterolo esaurimento (i passaggi 1,2-1,4) può essere fatto in concomitanza con la fase di opsonizzazione. Assicurati di trattare macrofagi prima di combinare la soluzione di lavoro, in quanto le cellule opsonizzati devono essere utilizzati in modo ottimale non più di 20 minuti dopo la fase di incubazione 3.4.3. </li></ol></li><li> Infettare macrofagi <ol><li> Macrofagi lavare due volte con siero DMEM gratuito e aggiungere 200 ml di opsonizzati C. neoformans soluzione di lavoro di ogni bene. </li><li> Incubare per 2 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix e colorare le cellule <ol><li> Rimuovere i supporti e lavare le cellule 2 volte con DMEM. </li><li> Far asciugare il monostrato cellulare per 10 minuti e aggiungere 200 ml di metanolo ghiaccio freddo per fissare le cellule. </li><li> Incubare per 15 minuti a RT e rimuovere il metanolo rimanente. </li><li> Aggiungere 200 ml di 10x Giemsa e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 2 - 3 volte con acqua deionizzata e asciugare O / N con cappuccio. NOTA: Imaging può essere fatto il giorno dopo o fino a una settimana following colorazione. </li></ol></li><li> Visualizza e Conte <ol><li> Utilizzando un microscopio, conta 300 cellule per punto dati (se ci sono 2 dello stesso trattamento contare 150 per bene) e annotare il numero di macrofagi infetti e il numero di cellule Cryptococcus inghiottito. NOTA: Per assicurare anche il campionamento per use punto dati 2 piastre per condizione, selezionare 3 aree non sovrapposte per piastra e conta 50 cellule per zona. </li><li> Calcolare indice phagocytic moltiplicando la percentuale di macrofagi infettati dal numero medio di C. neoformans per macrofagi. Normalizzare indice phagocytic esprimendo i valori in percentuale del 1x PBS trattati di controllo. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard della media per determinare le tendenze nell&#39;indice fagocitosi. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività. </li><li> Prendere microscopio di cellule a 1,000X o 400X di ingrandimento. </li></ol></li></ol> 4. Trypan Blue Assay <ol><li> In un armadio biosicurezza sterile, sementi 10 6 i macrofagi per pozzetto su una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti in un volume di 5 ml di mezzo minimo essenziale di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale ed 1% di penicillina / streptomicina . Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Esaurire macrofagi di colesterolo seguendo i passaggi 1,2-1,4 sostituendo 2 ml per 200 microlitri se del caso per tenere conto delle dimensioni ben più grandi. NOTA: Assicurarsi di includere un controllo trattato con 1x PBS, nonché un controllo che viene raschiata prima di qualsiasi trattamento. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1x PBS in ciascun pozzetto e raschiare delicatamente le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire in una provetta per microcentrifuga e sospendere le cellule pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Rimuovere 10 ml di cellule e macchia con 1 ml di 4% Trypan blu. </li><li> Contare le cellule su un emocitometro e calcolare la vitalità utilizzando la seguente equazione:% redditività = [1 - (cellule blu / cellule totali)]x 100. I valori Normalizzare al controllo che è stato non trattato. Dopo diverse prove calcolare il valore medio e la deviazione standard per determinare le tendenze in redditività. Utilizzare studente t-test per stabilire significatività. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Lavorando con questo protocollo è importante per ottenere il conteggio delle cellule accurate quando placcatura cellule di mammifero e opsonizzare C. cellule neoformans. Questo minimizza variazione tra prove e assicura un&#39;accurata 1: 1 bersaglio rapporto effettore tutto lo studio. È anche fondamentale per coordinare la tempistica della deplezione di colesterolo e per prevenire l&#39;infezione delle cellule di lievito o cellule opsonizzati macrofagi trattati di riposo a RT tra le procedure. Lunghi...

Fagocitosi è un processo attraverso il quale entita extracellulari vengono internalizzati dalle cellule ospiti. Si tratta di un&#39;arma fondamentale nell&#39;arsenale del sistema immunitario a difendersi contro gli agenti patogeni, ma il processo può spesso essere sovvertita da agenti patogeni per consentire l&#39;internalizzazione e la diffusione in tutto il corpo 1. Fagocitosi è mediata da diversi eventi di segnalazione che si traducono in attacco e fagocitazione via riarrangiamenti del citoscheletro della cellula ospite. Fagociti &#39;professionali&#39; sono in grado di riconoscere e legarsi a opsonine sulla superficie del patogeno invasore di segnalare per l&#39;attacco e la formazione di lamellipodia, che fagocitare l&#39;agente patogeno e formano un phagosome 2. Tra i cosiddetti fagociti &#39;professionali&#39; sono i macrofagi. I macrofagi sono cellule altamente specializzate che svolgono funzioni di protezione che includono ricercare e eliminare gli agenti patogeni, riparare tessuti danneggiati, e mediare l&#39;infiammazione, la maggior parte deiquesti attraverso il processo di fagocitosi 1,2. Cryptococcus neoformans è una specie di lievito patogeno che provoca una grave malattia nota come Criptococcosi. Spore Cryptococcus inalazione dall&#39;host e determinano un&#39;infezione polmonare che di solito è asintomatica. Si ritiene che l&#39;esposizione è estremamente diffuso; un campione di 61 bambini dalle malattie infettive Pediatric Clinic presso il Centro Ospedaliero Bronx-Lebanon trovato che tutti gli intervistati avevano anticorpi al glucuronoxylomannan polisaccaride criptococcica e altri studi hanno dimostrato la prevalenza sia il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV) non infetto e adulti infetti 3, 4. macrofagi alveolari sono la prima linea di risposta all&#39;infezione polmonare e in molti casi con successo chiaro patogeno. Tuttavia, in soggetti immunocompromessi (pazienti ad esempio, HIV e AIDS), il lievito è in grado di sopravvivere all&#39;interno dei macrofagi. In questicasi, i macrofagi possono servire come una nicchia per la replicazione del patogeno e possono facilitare la sua diffusione al sistema nervoso centrale (CNS) se la malattia diventa fatale 5 - 8. Si pensa che i macrofagi possono anche consegnare il lievito direttamente nelle meningi, aiutando il lievito di attraversare la barriera emato-encefalica tramite il modello &quot;cavallo di Troia&quot; 3,9 - 11. Pertanto, è importante comprendere il processo di fagocitosi ed i fattori che incidono su di esso, specialmente nelle infezioni da criptococco. Impieghi precedenti in altri sistemi patogeni puntare colesterolo e lipidi zattere formate da colesterolo come aventi un ruolo importante da svolgere in fagocitosi 12-15. Il colesterolo è la specie di lipidi più abbondante in cellule di mammifero e comprende 25 - 50% della membrana cellulare di mammifero 16. Si è trovato un ruolo nella modulazione della BIOPproprietà hysical di membrane di cambiare la loro rigidità 17. Colesterolo e sfingolipidi insieme formano microdomini lipidici all&#39;interno della membrana nota come zattere lipidiche. Raft lipidici sono stati trovati ad essere coinvolti nella formazione di caveolae, oltre a fornire un dominio isolato per alcuni tipi di segnalazione 16 - 18. A causa delle loro piccole dimensioni, è difficile studiare zattere lipidiche in vivo. Un modo utile per studiare il ruolo dei raft lipidici è quella di modificare i loro elettori. Metil-β-ciclodestrina (MβCD) è un composto che è stato trovato per esaurire il colesterolo dalle membrane mammiferi ed è comunemente utilizzato per studiare il ruolo dei raft lipidici 18. In questo protocollo, presentiamo un metodo per esaurire il colesterolo dalle membrane della cellula ospite e quantificare l&#39;effetto della deplezione sulla capacità delle cellule ospiti di fagocitare C. neoformans in vitro. Questo procedimento si avvale di coltura cellulare techniqUES su un macrofago immortalato come linea cellulare (J774A.1) come modello di infezione. Colesterolo deplezione stato compiuto mediante esposizione a MβCD, che ha un core idrofobico specifica alla dimensione di steroli ed è in grado di agire come un dissipatore per il colesterolo per disegnare fuori della membrana 19. Colesterolo esaurimento è stata misurata quantitativamente usando un kit disponibile in commercio e qualitativamente con una estrazione del grasso Bligh-Dyer modificato seguita da cromatografia su strato sottile (TLC) 20. . Fagocitosi è stata misurata infettando la linea cellulare con una cultura di lievito opsonizzati mescolato con un cocktail di interferone-γ e lipopolysaccharide per l&#39;attivazione dei macrofagi Cryptococcus stata opsonizzati utilizzando un anticorpo glucuronoxylomannan (GXM) 21 - 23. Colorazione e esperimenti di microscopia consentito per la visualizzazione delle cellule e calcolo dell&#39;indice fagocitaria per valutare il grado di fagocitosi. Nel loro insieme, questo protocollo dEscribes un metodo di base che integra l&#39;alterazione della composizione lipidica con un processo fisiologico.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

Criptococcosi è un&#39;infezione pericolosa per la vita causata da funghi patogeni del genere Cryptococcus. L&#39;infezione si verifica su inalazione di spore, che sono in grado di replicare nel polmone profondo. Fagocitosi di Cryptococcus dai macrofagi è uno dei modi in cui la malattia è in grado di diffondere nel sistema nervoso centrale per causare meningoencefalite letale. Pertanto, lo studio dell&#39;associazione tra Cryptococcus e macrofagi è importante per comprendere la progressione dell&#39;infezione. Il presente studio descrive un protocollo step-by-step per studiare macrofagi infettività da C. neoformans in vitro. Usando questo protocollo, il ruolo di steroli ospitanti sulle interazioni ospite-patogeno è studiato. Diverse concentrazioni di metile - ciclodestrina (MCD) sono stati usati per esaurire il colesterolo dal murino reticolo sarcoma macrofago-come linea cellulare J774A.1. Colesterolo esaurimento è stato confermato e quantificato utilizzando sia commercialmente available kit di colesterolo quantificazione e cromatografia su strato sottile. Cellule colesterolo impoverito sono stati attivati ​​mediante Lipopolysacharide (LPS) e interferone gamma (IFNγ) e infettati con anticorpi opsonizzati Cryptococcus neoformans wild-type cellule H99 ad un rapporto effettore-to-target di 1: 1. Le cellule infette sono stati monitorati dopo 2 ore di incubazione con C. neoformans e il loro indice di fagocitosi è stato calcolato. Colesterolo deplezione determinato una significativa riduzione dell&#39;indice fagocitaria. I protocolli presentati offrono un metodo conveniente per imitare l&#39;avvio del processo di infezione in un ambiente di laboratorio e studiare il ruolo della composizione lipidica host infettività.

Colesterolo Depletion Analisi del surnatante riservato al punto 1.3 del protocollo, seguendo le istruzioni del produttore del kit Colesterolo Assay Amplex Red produce un&#39;elevata concentrazione di colesterolo nel campione MβCD trattati rispetto al controllo 1x PBS. A seconda del tipo di cellula e l&#39;esaurimento colesterolo concentrazione MβCD utilizzato può variare. Per J774 trattati con MβCD 10 mM, è stato osservato un esaurimento di circa il 50%. Depletion può essere calcolato uti...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K Views.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

Video: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

Esaurimento e Ricostituzione dei macrofagi nei topi

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualizzazione non-litica Esocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Cultura dei macrofagi macrofagi colony-stimulating factor differenziata umana derivate da monociti

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

L'effetto dell'aspirina e dell'ibuprofane sulla capacità fagocitaria dei macrofagi

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di

Riepilogo

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