The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).

NOTA: Tutte le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dalla University of Louisville Istituzionale Comitato Biosicurezza (protocollo # 13-056) e Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 13-064). 1. Preparazione del colorante <ol><li> Diluire 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS e sterilizzare filtro con un filtro a siringa da 0,45 micron. </li></ol> 2. Preparazione di Pseudomonas aeruginosa cultura <ol><li> 15 ore prima instillazione, inoculare 3 ml di brodocoltura con una singola colonia batterica. </li><li> Crescere la coltura 15 ore a 37 ° C su un agitatore (200 rpm). </li><li> Centrifuga 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml 12.000 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire un&#39;aliquota del magazzino sospensione batterica 1:10 in PBS e misurare il diametro esterno 600 della sospensione batterica diluita per determinare lala concentrazione batterica. </li><li> Diluire la sospensione batterica magazzino in PBS alla concentrazione desiderata di inoculo batterico, utilizzando un volume di consegna di 50 microlitri per IMIT inoculazione. </li></ol> 3. IMIT instillazione <ol><li> Inserire un gruppo di topi in isoflurano camera di induzione di anestesia e anestetizzare con un 2 - miscela di isoflurano / ossigeno 3%. </li><li> All&#39;inizio iniziale di sedazione, collottola il mouse, tenendo premuto il mouse verticale, e somministrare 10 ml di una soluzione di lidocaina 2% mediante sonda gastrica dell&#39;ago alla parte posteriore della gola e consentire alla soluzione di scendere verso l&#39;epiglottide. Ritorna il mouse alla camera di anestesia. <ol><li> Lasciare almeno 5 minuti per consentire la lidocaina prendere pieno effetto come anestetico locale. </li></ol></li><li> Quando i topi hanno raggiunto il livello desiderato di sedazione (tasso di ~ 60 bpm respirazione), ridurre la isoflurano al 2% per mantenere la sedazione. </li><li> Precarico tintura o inoculo batterico in 250 ml a tenuta di gasprecisione siringa in forma con un lungo ago smussato 22 G. <ol><li> Prima elaborare 150 microlitri di aria, misurati mediante lo stantuffo della siringa teflon. Successivamente, elabora 50 ml di inoculo facendo avanzare lo stantuffo Teflon dal marchio 150 microlitri al segno 200 microlitri sul corpo siringa. NOTA: Quando il campione viene espulso in un mouse intubato, la sospensione 50 microlitri sarà trasportato primo, seguito da un cuscino d&#39;aria 150 microlitri che distribuirà l&#39;inoculo nel polmone. </li></ol></li><li> Rimuovere un mouse dalla camera di induzione e giaceva supino su una piattaforma intubazione. Fissare il mouse alla piattaforma agganciando i suoi incisivi con un O-ring attaccato al velcro strip, e fissare il velcro alla piattaforma. Sollevare il mouse per una pendenza di 45 °. </li><li> Usando un applicatore di cotone micro, ritrarre la lingua con un moto di rollio, con la mano dominante. </li><li> Con la mano non dominante, utilizzare una misura otoscopio operativo con una specula intubazione sia maintain la ritrattazione della lingua e visualizzare la glottide. </li><li> Con la mano dominante, utilizzare un filo guida filettato attraverso un catetere 20 G intubare il mouse, sedere il catetere ad una profondità da 10 mm nel trachea mouse (catetere è in forma di un manicotto in silicone con 10 mm di catetere esposta). Rimuovere l&#39;otoscopio / specula. </li><li> Verificare che il mouse è stato intubato correttamente, garantendo il catetere con la mano non dominante, mentre per breve tempo il collegamento di un Luer lunghezza collegata di 1/16 &quot;tubo trasparente contenente un colorante. NOTA: Il colorante viene rapidamente migrazione avanti e indietro in risposta alla respirazione. </li><li> Non procedere con i passi successivi, se la conferma di intubazione non è stata stabilita, a questo punto. Se l&#39;intubazione tentata non è riuscita, ripristinare il filo del catetere e la guida per un ulteriore tentativo a intubazione. NOTA: È sconsigliabile tentare più di due intubazioni di un topo in una sessione senza causare traumi al mouse. </li><li> Continuare afissare il catetere con la mano non dominante, mentre l&#39;inserimento della siringa di precisione / ago smussato contenente il cuscino di sospensione / aria liquida. </li><li> Erogare aria / liquido direttamente nei polmoni in un unico movimento fluido e rimuovere immediatamente l&#39;ago / catetere dal mouse. </li><li> Ritorna il mouse in una gabbia e permettere il recupero dall&#39;anestesia. </li></ol> 4. Caratterizzazione di IMT di consegna <ol><li> Dopo IMIT instillazione, eutanasia il mouse da CO 2 asfissia in un post-inoculazione momento opportuno. </li><li> Fissare il mouse eutanasia su una tavola di dissezione e godersi il torace e l&#39;addome con il 70% EtOH usando una bottiglia a zampillo. </li><li> Se la valutazione della distribuzione di un agente di imaging nel polmone, rimuovere i polmoni dal animale con tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l&#39;imaging. NOTA:. I polmoni possono essere preparate per ulteriori tecniche di colorazione istologiche mediante fissazione o crioconservazione del caso &lt;/ Li&gt; <li> Se la valutazione della carica batterica del tessuto polmonare infetto, togliere i polmoni dall&#39;animale con tecnica sterile. Luogo polmoni in una sterile, pre-pesate 1 sacchetto di campionamento oz. Pesare e registrare il peso del sacchetto di campionamento + polmoni. <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS sterile, 1x per ogni sacchetto di campionamento + tessuti. Richiudere sacchetto di campionamento. </li><li> Omogeneizzare i tessuti da dolce a rotazione un 25 ml pipetta sierologica nel sacchetto di campionamento + tessuto. </li><li> Generare diluizioni seriali del polmone omogenato in PBS sterile e piastra su piastra di agar (LB, o se del caso alla specie batteriche in fase di studio): <ol><li> Condurre una diluizione in serie di sei volte in un U-basso a 96 pozzetti da pipettatore multicanale allora piastra campioni in triplicato dal multicanale sulla piastra di agar. </li></ol></li><li> Incubare le piastre di agar per una notte a 37 ° C ed enumerare le unità formanti colonie il giorno successivo. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

IMIT instillazione offre miglioramenti chiave per modelli di malattie respiratorie già esistenti nella capacità di infondere riproducibile reagenti direttamente nei polmoni. Si tratta di un approccio veloce che si trova in posizione ideale per una squadra di due ricercatori, uno dei quali gestisce la logistica di anestesia e ingabbiamento, e l&#39;altro che esegue la tecnica IMIT. I grandi studi possono essere condotti utilizzando IMIT con un impegno medio di tempo di 2 - 3 minuti per mouse. Poiché l&#39;approccio fa uso di isoflurano come anestetico, topi recuperare rapidamente dall&#39;anestesia, riducendo il tempo di allevamento di animali controllo attraverso il recupero. L&#39;aspetto più tecnicamente impegnativo del metodo IMIT è il passo iniziale di intubazione topi. Gli individui che imparano a svolgere IMIT sono in grado di concentrarsi su questo primo passo di posizionamento del catetere e la garanzia che l&#39;intubazione è stato raggiunto attraverso la conferma visiva di movimento tintura. Il vantaggio di questo approccio è che il polmone-specific instillazione è garantita attraverso l&#39;uso della conferma di intubazione, che aumenta la fiducia sia del nuovo ricercatore nonché l&#39;esperto tentativo di intubazione un animale difficile. Gli elementi chiave per ottimizzare la probabilità di una intubazione di successo sono: i) il raggiungimento di un sedazione profonda per dare il tempo di lavoro sufficienti, ii) il corretto posizionamento del specula in bocca per permettere una buona visualizzazione della epiglottide, iii) l&#39;inserimento di una buona profondità del specula in modo che la linguetta rimane retratto durante tutta la procedura, e iv) utilizzo della piattaforma di ribaltamento per supportare mani del ricercatore in modo che la procedura è condotta rilassata e con un comportamento costante. Uno dei limiti della procedura IMIT è legato alla frequenza degli eventi IMIT instillazione. A causa del trauma potenziali associati con intubazione perso, non è consigliabile che più di due tentativi di intubazione essere condotti in una singola sessione (fino a due miss). IMITha un ottimo potenziale nella sua capacità di essere utilizzato per fornire terapie nel polmone murino, i regimi terapeutici ma che si avvalgono di consegna molto frequente di reagente nei polmoni non possono essere adatti per IMIT. Può essere possibile che IMIT potrebbe essere utilizzato quotidianamente per fornire reagenti in un polmone murino senza causare traumi significativi, ma solo se condotta da un ricercatore altamente qualificato, come la maggior parte dei traumi associati con intubazione è pensato per essere associato ad un evento intubazione perdere . Tale IMIT ad alta frequenza dovrebbe essere discusso con i veterinari locali e IACUC. Un potenziale limite ulteriore IMIT è la dimensione del mouse che viene intubato. La procedura IMIT sopra descritta è stata sviluppata usando topi di circa 17-22 g, dove è stato trovato un catetere 20 G per essere un formato adatto per la trachea di topi in questo intervallo di grandezza. Cateteri più grandi sono stati utilizzati con successo nei topi anziani; lo sviluppo iniziale di IMIT muso facciata di un catetere 18 G topi BALB / c che sono&gt; 20 g. È importante sottolineare che, se si utilizzano i formati alternativi cateteri, aghi smussati devono essere di provenienza che si adattano il lume del catetere e sono tagliati ad una lunghezza che si estende appena 1 millimetro al di là della punta del catetere. Intubazione di topi di dimensioni inferiori a 17 g può essere possibile, ma non è raccomandato a causa della esperienza richiesta, e richiederebbe l&#39;uso di cateteri più piccoli e specula che sono descritti in precedenza. Abbiamo usato IMIT per la consegna di diversi patogeni respiratori oltre a P. aeruginosa, compresi B. pseudomallei 9 e Klebsiella pneumoniae 10. Il modello IMIT ha conseguito notevoli progressi per i nostri studi di B. malattie respiratorie pseudomallei, dopo aver individuato che l&#39;inoculazione intranasale provoca un precoce, morbilità URT-correlata di topi piuttosto che l&#39;endpoint malattia sistemica osservata nella malattia umana 9. B. pseudomallei è un Tier 1 Selecagente t di impatto biodefense, e come si stanno sviluppando tali, modelli di malattie respiratorie per l&#39;esposizione di aerosol che modelli un biodefense correlato potenziale via di ingresso per patogeni come arma. Dato che i modelli attuali aerosol provocano l&#39;infezione sia della URT e LRT, gli stessi potenziali fenotipi presto morbilità abbiamo individuato per il modello intranasale di B. malattie respiratorie pseudomallei può applicare al modello di aerosol. Un futuro adattamento del modello IMIT potrebbe essere una consegna di aerosol intubazione-mediata (IMAD), in cui i topi sono intubato per la consegna porta aerosol solo nel polmone. Ventilatori meccanici sono attualmente disponibili per mantenere l&#39;anestesia isoflurano, che potrebbe essere adattato per fornire una, piuttosto che a base liquida, sfida patogeno aerosol. IMIT stato sviluppato inizialmente come un approccio per ottimizzare l&#39;erogazione dei batteri al polmone, ma ha anche un&#39;applicazione per la consegna di altri reagenti nel polmone del mouse. Come disdiscussi sopra, consegna intranasale di composti in topi determina una bassa efficienza, consegna altamente variabile dei reagenti nell&#39;organo bersaglio del polmone. Consegna intranasale di Positron Emission Tomography (PET) reagenti di imaging al polmone murino ha prodotto un rendimento di consegna del 40% 11, mentre abbiamo dimostrato che IMIT offre un&#39;ottima alternativa per l&#39;altra consegna del polmone si avvicina con il suo&gt; 98% di efficacia consegna e la distribuzione multilobare. Questo miglioramento somministrazione mirata al polmone ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di consegna terapeutico per il trattamento della malattia polmonare. IMIT simile potrebbe offrire vantaggi agli studi di: i) l&#39;impatto delle sostanze irritanti polmonari ambientali, ii), del cancro del polmone studi fenotipici, iii) specifici siRNA-polmone knock-down.

I topi sono stati utilizzati per modellare numerose manifestazioni della malattia umana, compresa una miriade di malattie respiratorie. Modelli di malattia surrogate sono spesso in grado di ricapitolare tutti gli aspetti di una malattia modellato, in genere a causa di importanti fisiologica o differenze immunitarie nei due modelli di accoglienza. Pertanto, l&#39;obiettivo di migliorare i sistemi di modello è quello di sviluppare approcci che consentono surrogati a specchio più da vicino un processo patologico o ospitano risposta come osservato nel sistema host originale. Ci sono parecchie differenze fisiologiche fondamentali tra i topi e gli esseri umani nel meccanismo con cui si ispirano l&#39;aria. Inclusi in queste differenze sono significative differenze raziometriche di dimensioni tra vie aeree superiori e LRT. È stato stimato che i topi possiedono&gt; 100 volte la superficie URT rispetto agli esseri umani, normalizzati contro totale 1,2 capacità polmonare. Così, turbinati nasali del mouse consentono più ampio filtraggio dell&#39;aria inspirata per facilitare una maggiore velocità di breathing, che può avere un impatto significativo sugli studi di polmonite se l&#39;infezione della cavità nasale svolge un ruolo significativo nella progressione della malattia. Diversi approcci sono stati impiegati per infondere batteri nei polmoni di topi per studiare le malattie respiratorie simile a quella umana. Il più comune di questi approcci è inoculazione intranasale, in cui una sospensione liquida viene applicato in una o entrambe le narici di un mouse. Mentre relativamente semplice, avvertimenti come volume instillazione e tipo di anestesia utilizzati possono influenzare l&#39;efficienza della instillazione nel LRT via intranasale inoculazione 3-5. In particolare, Miller et al. hanno dimostrato che l&#39;instillazione intranasale di Francisella tularensis in volumi meno di 50 ml non hanno comportato l&#39;instillazione dei batteri nel LRT 6. Essi hanno inoltre osservato meglio LRT instillazione quando si usa isoflurano per via inalatoria rispetto a iniettato ketamina / xylazina per l&#39;anestesia. Tuttavia, la nostra esperienze con Yersinia pestis inoculazione intranasale indica inoculazione più coerente può essere raggiunto utilizzando ketamina / xylazina rispetto a isoflurano (MBL, dati non pubblicati). Queste differenze potrebbero essere attribuite a patogeno usata o variabilità nella procedure di laboratorio, ma soprattutto evidenziare il potenziale di variabilità in questa tecnica. Inoltre, polmoni raccolte poco dopo instillazione intranasale mostrano che una percentuale relativamente bassa dell&#39;inoculo batterico iniziale raggiunge il polmone (nel caso di Y. pestis, solo il 10% sono stati recuperati 1 ora dopo l&#39;instillazione 7), suggerendo che un gran numero di batteri potrebbe essere mantenuta nel URT (o ingerito nel tratto GI). In alcuni modelli di malattia, questo significativo deposito di batteri sulla mucosa URT può confondere la nostra comprensione della progressione della malattia se l&#39;organismo è in grado di colonizzare la cavità nasale murino in modo incompatibile con la malattia umana. Per esempio, usando in vivo &lt;/ Em&gt; di imaging, è stato osservato che Burkholderia pseudomallei, che non colonizzano l&#39;URT umana, provoca un&#39;infezione opportunistica schiacciante della cavità nasale murino al momento della consegna con il metodo instillazione intranasale 8. Altri metodi per instillare i batteri nei polmoni di topi sono stati impiegati nella ricerca sulle malattie infettive. Tuttavia, rispetto al instillazione intranasale questi metodi tendono a richiedere maggiore competenza tecnica e / o costose attrezzature senza eliminare il rischio di infezione da iniziazione in più siti (ad esempio, aerosol [URT e LRT]; transoral [tubo digerente e LRT], e intratracheale chirurgica [LRT e sangue]). Date le complicazioni potenziali che potrebbero essere associati con i siti secondari di infezione, abbiamo cercato di sviluppare un approccio endotracheale che bypassa vie aeree superiori e fornisce patogeno direttamente nei polmoni di topi anestetizzati, ma limita anche inoculat accidentaleione nel flusso sanguigno o del tratto gastrointestinale. A tal fine, l&#39;intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione è stato sviluppato come una procedura non chirurgica che garantisce LRT instillazione di inoculo, includendo una fase intermedia per verificare il corretto posizionamento del catetere prima della instillazione. Questo metodo viene descritto usando colorante instillazione di dimostrare visivamente ampia distribuzione dell&#39;inoculo nel polmone, e P. aeruginosa instillazione per dimostrare la consegna altamente efficace (&gt; 98% dell&#39;inoculo) di questo metodo per il polmone. È importante sottolineare che, mentre originariamente sviluppato per la consegna batterica, IMIT offre anche un efficace strumento per: i) instillazione di varie molecole per lo studio di altri modelli di malattie respiratorie, ii) la consegna terapeutiche particolari-polmone, e iii) studi di funzionalità polmonare di base, tra cui mirate consegna di siRNA al polmone.

<table><tbody><tr><td>Rodent, Tilting WorkStand</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Base should be detached when working in a BSC</td></tr><tr><td>Operating Otoscope Head</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscope 3.5 V Li Battery</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Incisor Loops</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fine tip applicator</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&amp;nbsp;</td><td>Used for tongue retraction</td></tr><tr><td>I.V. Catheter, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface</td></tr><tr><td>Gas tight syringe, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Used for delivery of liquid inoculum by IMIT</td></tr><tr><td>Blunt Needle, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter</td></tr><tr><td>Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Cut to 6&quot; length: used as guide wire for intubation</td></tr><tr><td>Tuberculin syringe, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Assemble with fiber optic wire as guide wire</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing, 1/16&quot;</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer 1/16&quot; barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer 1/16&quot; barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Sample bag, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plate, sterile</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system

Studi sulle malattie respiratorie in genere comportano l&#39;uso di modelli murini come sistemi sostitutivi. Tuttavia, ci sono notevoli differenze fisiologiche tra il topo e respiratorio umano, in particolare nelle loro vie respiratorie superiori (URT). In alcuni modelli, queste differenze nella cavità nasale murino possono avere un impatto significativo sulla progressione della malattia e la presentazione nel tratto respiratorio inferiore (LRT) quando si utilizzano tecniche di instillazione intranasale, potenzialmente limita l&#39;utilità del modello di topo per studiare queste malattie. Per questi motivi, sarebbe vantaggioso sviluppare una tecnica di instillare batteri direttamente nei polmoni topo per studiare la malattia LRT in assenza di coinvolgimento delle vie aeree superiori. Abbiamo chiamato questa specifica tecnica di fornitura intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione del polmone. Questa tecnica non invasiva minimizza il potenziale per instillazione nel sangue, che può verificarsi durante tradizio più invasiveapprocci chirurgici onal intratracheali infezione, e limita la possibilità di consegna tratto digestivo incidentale. IMIT è un processo in due fasi in cui i topi vengono prima intubati, con una fase intermedia di garantire il posizionamento del catetere corretta nella trachea, seguiti da inserimento di un ago smussato nel catetere di mediare consegna diretta dei batteri nei polmoni. Questo approccio permette un&#39;efficacia&gt; 98% della fornitura nei polmoni un&#39;eccellente distribuzione del reagente nel polmone. Così, IMIT rappresenta un nuovo approccio per studiare le malattie LRT e spedizione terapeutica direttamente nel polmone, migliorando sulla capacità di utilizzare topi come surrogati per studiare malattie respiratorie umane. Inoltre, la precisione e la riproducibilità del sistema di erogazione rende anche suscettibili di buona prassi di laboratorio (GLP), così come la consegna di una vasta gamma di reagenti che richiedono elevata efficienza di consegna al polmone.

Per visualizzare la distribuzione di materiale instillato attraverso il metodo IMIT, 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue tintura è stato instillato nei polmoni di un topo anestetizzato. Il mouse è stato immediatamente eutanasia ei polmoni sono stati rimossi dalla necroscopia sterile. La figura 1 mostra che il colorante è stato consegnato a tutti i lobi del polmone. Per determinare la quantità di batteri consegnato ai polmoni tramite il metodo IMIT, tre gruppi di topi (n = 3) sono stati instillato con tre differenti concentrazioni di P. aeruginosa (1.21 x 10 8, 1.21x10 7, e 1,21 x 10 6 unità formanti colonie [CFU] per 50 microlitri). Subito dopo IMIT instillazione, i topi sono stati sacrificati, polmoni rimossi e numeri batteriche sono state enumerate e confrontate con i inoculums (Figura 2). Consegna dell&#39;inoculo è molto efficace tramite questo metodo, con&gt; 98% dell&#39;inoculo recuperato dai polmoni di instillatoanimali. Inoltre, IMIT instillazione era altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione di inoculo (R 2 = 0,9951). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figura 1: IMIT instillazione distribuisce inoculo nel corso dei polmoni polmoni di topi instillato con 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue spettacolo colorante blu distribuite in tutti i lobi.. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figura 2:. IMIT instillazione di batteri nei polmoni topi sono stati instillato con P. aeruginosa e il numero di batteri instillati nei polmoni (Log 10 CFU - recuperata) sono stati confrontati con l&#39;inoculo stimato (Log 10 CFU - distribuito). Ogni cerchio rappresenta la UFC / polmone di un mouse individuale (n = 3 per ogniDose batterica).

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Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

intubation-mediated-intratracheal-imit-instillation-noninvasive-lung

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

24.2K Views.  University of Louisville Medical School.  Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica. 

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medicina

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

Diretta instillazione tracheale di soluti in polmone mouse

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Biologia

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillazione e fissaggio Metodi utili in mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper introduces a noninvasive method of intratracheal delivery of dry powder formulation in mice. A dry powder loading device that consists of a 200 &#181;L gel loading pipette tip connected to an 1 mL syringe via a three-way stopcock is presented. A small amount of dry powder (1-2 mg) is loaded into the pipette tip and dispersed by 0.6 mL of air in the syringe. Because pipette tips are disposable and inexpensive, different dry powder formulations can be loaded into different tips in advance. Various formulations can be evaluated in the same animal experiment without device cleaning and dose refilling, thereby saving time and eliminating the risk of cross-contamination from residual powder. The extent of powder dispersion can be inspected by the amount of powder remaining in the pipette tip. A protocol of intubation in mouse with a custom-made light source and a guiding cannula is included. Proper intubation is one of the key factors that influences the intratracheal delivery of dry powder formulation to the deep lung region of the mouse.

Dry powder formulations for inhalation have great potential in treating respiratory diseases. Before entering human studies, it is necessary to evaluate the efficacy of the dry powder formulation in preclinical studies. A simple and noninvasive method of the administration of dry powder in mice through the intratracheal route is presented.

Somministrazione intratracheale della formulazione di polvere secca nei topi

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered drug. This has direct translational impact because surfactant and drugs are administered locally into the lungs. Though the literature has many publications describing minimally invasive transoral intubation of adult mice and rats in therapeutic experiments, this approach in neonatal rat pups is lacking. The small size of orotracheal region/pharynx in the pups makes visualization of laryngeal lumen (vocal cords) difficult, contributing to the variable success rate of intratracheal drug delivery. We hereby demonstrate effective oral intubation of neonatal rat pup - a technique that is non-traumatic and minimally-invasive, so that it can be used for serial administration of drugs. We used an operating otoscope with an illumination system and a magnifying lens to visualize the tracheal opening of the rat neonates. The drug is then instilled using a 1 mL syringe connected to a pipette tip. The accuracy of the delivery method was demonstrated using Evans blue dye administration. This method is easy to get trained in and could serve as an effective way to instill drugs into trachea. This method could also be used for administration of inoculum or agents to simulate disease conditions in animals and, also, for cell-based treatment strategies for various lung diseases.

This technique of instilling drugs directly into the trachea of neonatal rodents is important in studying the impact of locally administered drugs or biologicals on neonatal lung diseases. Additionally, this method can also be used for inducing lung injury in animal models.

Un metodo minimamente invasivo per l'instillazione intratracheale di farmaci nei roditori neonatali per il trattamento delle malattie polmonari

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Simplifying Transcutaneous Intratracheal Drug Delivery in the Newborn Preterm Rabbit

Intratracheal (IT) drug delivery allows the direct delivery of pharmaceutical substances to the lung, maximizing potential pulmonary benefit and minimizing systemic drug exposure. The transcutaneous technique is simple and allows for the IT delivery of substances to the lung of prematurely born rabbits shortly after birth. Newborn pups are anesthetized with inhaled Isoflurane before being placed in a supine position with the neck extended. The larynx is identified and stabilized before transcutaneous placement of a 26-gauge (G) catheter into the trachea. Following catheterization of the trachea, a 30 G blunt needle attached to a Hamilton syringe is introduced into the IT catheter and is used for delivering a precise volume into the trachea during spontaneous respiration. After the IT injection is completed, the needle and catheter are withdrawn, and the pup is allowed to recover from anesthesia. Transcutaneous IT injection delivers a large proportion of the injected substance to the lung, with the majority remaining in the lung 3 hours after the intervention. The injections are well tolerated from the day of birth and can be repeated for multiple consecutive days without influencing survival. This technique can be used to investigate the effect of pharmaceutical agents on lung development and in the prevention of neonatal lung injury in preterm rabbits.

Transcutaneous intratracheal injection allows for effective intrapulmonary drug delivery during spontaneous respiration. Single and multiple injections are well tolerated with no effect on survival. The technique is simple to perform and can examine the effect of substances on lung development and the prevention of lung injury in newborn rabbits.

Intratracheal (IT) drug delivery allows the direct delivery of pharmaceutical substances to the lung, maximizing potential pulmonary benefit and ...

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of acute lung injury or acute inflammation. The current most commonly used methods in acute lung injury mouse models are an intraperitoneal injection of LPS and tracheostomy for the tracheal infusion of LPS. However, the former method lacks lung targeting and damages other organs, and the latter method induces operative trauma, infection risk, and a low survival rate. Here, we recommend a noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation method for LPS instillation in mice. In this method, LPS is noninvasively introduced into the trachea through the oropharyngeal cavity to be instilled into the lung with the help of an apparatus for endotracheal intubation. This method not only assures lung targeting but also avoids damage and the risk of death in the animals. We expect that this approach will become widely used in the field of acute lung injury.

Here, we propose a protocol for intratracheal lipopolysaccharide (LPS) delivery via noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation. This method minimizes the trauma of the surgical procedure for the animal and accurately delivers LPS to the trachea and then to the lungs.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...