Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dal comitato Animal Istituzionale Cura e uso presso l&#39;Università di Louisville, in osservanza delle disposizioni federali. 1. Preparazione di Low Ca 2+ e 2 mM Ca 2 + artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) Perfusates <ol><li> Preparare 2x bassa Ca 2+ (0,1 mM) Stock tampone C, 2x normale Ca 2+ (2 mM) Stock Un buffer, e tampone 2x Archivio B come descritto nella Tabella 1. Le singole soluzioni stock consentono modifica del contenuto di ioni (ad esempio, basso o nullo Ca 2+) e può essere conservato a 4 ° C per un mese. </li><li> Per intracardiaca perfusione durante la dissezione, aggiungere 100 ml di 2x basso Ca 2+ della C e 100 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di plastica per rendere basso Ca 2+ 1x aCSF. Mescolare e conservare una notte a 4 ° C o fare fresco. </li><li> Per perfusione ex vivo del midollo spinale durante imagING, aggiungere 500 ml di 2x normale Ca 2+ Stock A e 500 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di vetro da 1 L per generare 1x aCSF. Mescolare e conservare notte a temperatura ambiente o fare fresco. </li><li> Aggiustare il pH del buffer ACSF a 7,4. Mantenendo la aCSF a temperatura ambiente, collocare il basso Ca 2+ aCSF su ghiaccio e poi bolla entrambi i buffer con gas carbogeno (95% O 2; 5% CO 2) per 30 minuti prima dell&#39;uso e continuamente durante la perfusione. </li></ol> 2. Preparazione di Ex Vivo Imaging Camera <ol><li> Avvolgere una coperta di riscaldamento (senza spegnimento automatico) intorno alla bottiglia aCSF e regolare la fiamma al minimo l&#39;impostazione / media. </li><li> Inserire una linea di perfusione aCSF dedicata nella bottiglia collegata ad una pompa di perfusione e in linea riscaldatore che è controllata da una sonda bipolare regolatore di temperatura e retroazione della temperatura, come mostrato nella Figura 1A. </li><li> Fissare un microscopio piatta inserto fase (152 x 102 mm) per la 2-fotoni di eccitazione / confpalco microscopio Ocal dotato di un contenitore di fuoriuscita. </li><li> Mettere un grande camera di perfusione open-bagno (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) nel contenitore fuoriuscita di accogliere e fornire un flusso continuo di fresco ossigenato aCSF al midollo spinale ex vivo (vedi Figura 1B per un ex adeguato Vivo l&#39;imaging disegno della camera). </li><li> Collegare la porta di uscita del metallo del riscaldatore in linea alla camera di ex vivo di immagini utilizzando tubi adatti. Inserire un tampone assorbente sottile sotto della camera ex vivo imaging per aiutare a mantenere la temperatura del buffer / tessuto durante l&#39;imaging. </li><li> Rispettare la camera di ex vivo imaging per il fondo dell&#39;inserto container fuoriuscita / stage con tack appiccicoso rimovibile. La malleabilità del tack appiccicoso consentirà la camera da regolare come necessario per garantire percorso ottico del obiettivo è perpendicolare alla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare un livello Bullseye per regolare la camera. </li><li> Fissare unsonda in linea risposte riscaldatore temperatura vicino alla camera di ingresso del fluido e un tubo di aspirazione in acciaio inox collegato ad una linea di vuoto all&#39;uscita della camera. Supporti a nastro magnetico e appropriato micropipetta sono utili in questo senso. Accendere la sorgente di vuoto. </li><li> Accendere la pompa di perfusione per iniziare a riempire la camera di imaging con aCSF ossigenato. Impostare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto. </li><li> Controllare il volume del aCSF nella camera di imaging regolando la linea del vuoto. È importante che vi sia sufficiente aCSF nella camera di imaging per coprire il segmento del midollo spinale e permettere sufficiente distanza di lavoro tra un obiettivo immersione acqua e la superficie del tessuto. La mielina e gli assoni possono essere negativamente influenzate se il segmento di tessuto non è completamente immerso in fresco ossigenato aCSF porta artefatti per sperimentatore-indotte. </li><li> Regolare il regolatore di temperatura del riscaldatore in linea in modo che la temperatura perfusato nella camera di imaging è temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissezione di adulti Murine cervicale del midollo spinale <ol><li> Euthanize un adulto 6-10 settimane di età Thy1 -YFP topo transgenico (uso ceppo appropriato che ha l&#39;espressione della proteina fluorescente in radice dorsale neuroni gangliari) iniettando una dose eccessiva del pentobarbital sodico anestesia (200 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Una volta sotto il corretto livello di anestesia (per esempio, nessuna reazione a pizzico punta e perdita di riflesso corneale), barba accuratamente la pelle sovrastante il midollo spinale e il cervello con i tagliatori chirurgici. Detergere la pelle con betadine e il 70% pastiglie etanolo. </li><li> Spray al torace / addome con il 70% di etanolo, quindi profumato il soggetto transcardiaca utilizzando refrigerata, CarboGen-bolle basso Ca 2+ aCSF. (Vedi Figura 1C per il banco di dissezione suggerito top istituito). </li><li> Come il fegato impallidisce, fissare l&#39;ago perfusione nel cuore con un piccolo clip. Girare il soggetto sopra per accedere al lato dorsale rasata diil soggetto e pulire la zona rasata con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un incisione cutanea dorsale lungo la linea mediana a partire dal naso all&#39;hip con le forbici dissezione per esporre il cervello e la colonna vertebrale (Figura 2A). Fissare la preparazione mettendo perni al naso e anca. </li><li> Utilizzando un microscopio di dissezione da questo punto in poi, saldamente tagliare attraverso la superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi. Inserire una delle punte forbice nei bordi laterali della incisione e taglio lungo i bordi della calotta cranica bilateralmente fino cervelletto. NOTA: Non accise completamente la calotta cranica, come è necessario in seguito a sollevare il tessuto sovrastante dal midollo spinale durante la dissezione (Figura 2B). </li><li> Sollevare la calotta cranica per esporre il cervello. Tagliare delicatamente i bordi destro e sinistro del midollo interparietale (situato il cervelletto) e tirarlo indietro caudale per esporre il tronco cerebrale / midollo spinale (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Usare le forbici fine punta terranno a un angolo di 45 ° rispetto alla superficie della tavola e tagliare le vertebre bilateralmente appena inferiore alle radici nervose posteriori. NOTA: Evitare il contatto con le colonne dorsali bianche luminose. Queste fibre sono quelli che verranno immagine (Figura 2D) e possono essere facilmente danneggiati. </li><li> Sollevare la superficie zucchetto e dorsale della colonna vertebrale, con pinza sottile a punta, tirando delicatamente il tessuto sovrastante in un unico pezzo, come i tagli sono fatti per esporre il midollo spinale. Continuare a tagliare vertebre al livello superiore del torace per isolare un segmento 1-2 cm del midollo cervicale per la successiva formazione immagine (figura 2E). </li><li> Usare le forbici per tagliare il parallelo di tessuto / ossea alla colonna vertebrale e dei tessuti chiari sotto la colonna. Rendere questi tagli come livello possibile. È molto importante che il tessuto sia piatto nella camera in modo che il cavo sia in piano per l&#39;imaging. </li><li> Utilizzare un # 11 bisturi al transetto del tronco cerebrale (oltre ilterminazione delle fibre fasciculus gracili) ea livello toracico superiore per isolare il segmento midollo spinale cervicale (vedere Figura 2F). Usare le forbici per tagliare il tessuto / ossea a questi stessi due punti. Il tessuto isolato dovrebbe contenere i 2/3 della colonna vertebrale, che comprende il tronco cerebrale caudale, l&#39;allargamento cervicale, e del midollo spinale toracico superiore (Figura 2G). </li><li> Porre la colonna vertebrale isolato in una scatola Petri di CarboGen-bollito, raffreddato a basso Ca 2+ aCSF. Se necessario, tagliare il tessuto sotto la colonna vertebrale fino a adagiata nel piatto. </li><li> Trasferire la colonna vertebrale isolata alla camera di imaging ex vivo e aumentare gradualmente la temperatura perfusato più di 1 ora a 36-37 ° C. Mantenere questa temperatura durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. Posizionamento di Ex Vivo midollo spinale in Imaging Camera e mielina Etichettatura con Nile Red <ol><li> Fissare adeguatamente la colonna vertebrale in iCamera Maging con un appropriato fetta raccordo tenere premuto modificata con una piattaforma griglia verticale costituita da fili sottili Lycra (rimuovere le discussioni centrali della piattaforma di rete per consentire lo spazio per il midollo spinale; vedi Figura 3A). </li><li> Scongelare una aliquota di Nile Red (5 stock mM in DMSO e 0,22 micron filtrato; possono essere memorizzate per 1 mese a 4 ° C, o 6 mesi a -20 ° C al buio). Appena prima di aggiungere Nilo Red alla camera di imaging, ridurre la portata della pompa di perfusione e regolare la linea del vuoto per assicurare il fluido nella camera comprende sempre il midollo spinale. </li><li> Aggiungere 5-10 ml di soluzione madre Nile Red alla camera di imaging verso la fine caudale del cavo (Figura 3B). Utilizzare una pipetta 1 ml di mescolare delicatamente Nile Red in tutta la camera. Lasciare Nile Red di rimanere in camera per 1-2 minuti, quindi inserire la linea del vuoto indietro e regolare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto di perfusione continuamente il midollo spinale. </li><li> Sollevare con cautela palco microscopioe allineare l&#39;obiettivo con il centro del segmento del midollo spinale e medialmente sulle colonne dorsali finché l&#39;obiettivo ad immersione acqua è circa 10 mm dalla superficie del aCSF nella camera. Usate il microscopio volante fuoco revolver per portare lentamente l&#39;obiettivo verso il basso fino a toccare leggermente la superficie del aCSF. Utilizzare una sorgente luminosa epifluorescente concentrare le colonne dorsali nel campo di vista (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex Vivo Imaging del cavo del mouse spinale con TPLSM e laser-indotta Spinal Cord Injury (Lisci) NOTA: La vena posteriore fornisce un marcatore utile per centrare il tessuto come le fibre Fasciculus gracili (provengono dal corpo cellulare dei gangli spinali e salire da T6 e sotto lungo la linea mediana del midollo spinale) in parallelo con questo vaso sanguigno. Le spesse YFP + cervicale proiezioni radici dorsali forniscono anche un indicatore utile come fibre salire e scendere lateralmente alla YFibre FP + Fasciculus gracile che sono più piccoli di diametro. <ol><li> Una volta che il tessuto del midollo spinale è allineato in modo appropriato, passare alla modalità di scansione laser per eseguire l&#39;imaging di base degli ascendenti fasciculus gracile fibre mieliniche. Per eccitare sia YFP e Nilo Red, utilizzare una sorgente laser a due fotoni sintonizzati a 950 nm (~ 17 mW misurata all&#39;uscita di un 25X, 1.1 obiettivo NA) e dicroici appropriate (DM) e filtri passa-banda per isolare l&#39;emissione fluorescente dei fluorofori (usiamo 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 e, per separare YFP e Nilo rosso al giallo-arancio, rosso e canali estesi, rispettivamente). <ol><li> Se più del 3% degli assoni mostrano sferoidi assonali durante l&#39;imaging di base (30-60 min), eliminare la preparazione a causa di artefatti sperimentatore-indotta. </li></ol></li><li> Indurre un Lisci ingrandendo il campo visivo a 30.3X (per creare un diametro ablazione ~ 20 micron). Tune il laser a 800 nm, e aumentare la potenza del laser a ~ 110 mWil campione. Lasciare 5 completo campo delle scansioni vista laser per garantire le fibre sono completamente recisi. </li><li> Confermare Lisci modificando le impostazioni laser alle impostazioni di imaging (950 nm, 17 MW a campione, 2.08X) e scansionare il tessuto di visualizzare l&#39;ablazione. Verificare il diametro dell&#39;ablazione e che gli assoni ablazione primari sono completamente sezionato (vedere Figura 3D). Utilizzare le impostazioni di time-lapse sul microscopio combinato con z cattura per registrare la risposta dinamica di assoni e mielina per infortunio fino a 8-10 + hr dopo l&#39;infortunio. NOTA: Se l&#39;ablazione è incompleta (cioè, transection incompleta di fibre), scartare la preparazione, la determinazione dei meccanismi di lesioni primarie e secondarie saranno confusi. Inoltre, isolati segmenti del midollo spinale possono essere esposte fino a 24 ore post-Lisci con solo lieve a moderata danno tissutale Lisci-indipendente. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descriviamo un metodo dell&#39;imaging ex vivo midollo spinale assoni mielinizzati (cioè, fasciculus gracile) combinata con una lesione del midollo spinale indotta da laser per studiare la progressione dinamica sia degenerazione assonale mieliniche primaria e secondaria nel tempo. Ex vivo immagini della superficie di midollo spinale supera molte delle complicazioni associate con l&#39;imaging in vivo come artefatti di movimento e il potenziale di ipossia sperimentatore indotta durant...

La degenerazione degli assoni è una causa importante di morbilità abbracciano diverse condizioni neurologiche tra cui neurotrauma, ictus, autoimmuni e malattie neurodegenerative. A differenza del sistema nervoso periferico (PNS), sistema nervoso centrale (SNC) assoni hanno una limitata capacità di rigenerare volta feriti causa sia barriere intrinseche ed estrinseche (cioè, molecole inibitrici della crescita assonale prodotti durante la formazione di cicatrici e liberato durante mielina degenerazione) 1 -7. Sebbene molti di questi ostacoli sono stati ampiamente esplorato, interventi terapeutici mirati per prevenire CNS degenerazione assonale, promuovere la rigenerazione assonale robusto, e ripristinare connectively funzionale, restano limitati. Gli assoni una volta separati dal loro soma subiscono un processo di degenerazione stereotipata nota come degenerazione walleriana che è caratterizzata da gonfiore assonale, formazione sferoidale ed eventuale frammentazione (rivisto in 8). Incontrasto, il moncone prossimale che rimane in continuità con la soma di un assone periferiche transected, forma una tumefazione alla sua estremità, muore al nodo più vicino di Ranvier, e può quindi avviare la crescita formazione cono, un prerequisito vitale necessario per la successiva rigenerazione assonale 9-11. Al contrario, le terminazioni degli assoni prossimali di molti assoni centrali caratteristica forma &quot;endbulbs&quot; o lampadine retrazione, non riescono a formare coni di crescita, e invece rientrare dal sito della lesione dove rimangono per mesi dopo l&#39;infortunio 12-15. Oltre al danno assonale primario, ulteriore danno assonale / perdita può verificarsi anche a assoni che sono stati in gran parte risparmiata dalla lesione iniziale. Questa perdita assonale ritardato di assoni inizialmente risparmiati viene definita degenerazione assonale secondaria. Questa risposta inerente assoni del SNC al danno rende la rigenerazione assonale funzionale un obiettivo ancora più difficile da raggiungere nel cervello e nel midollo spinale. Anche se hallmarks di danno assonale (ad esempio, la formazione sferoide, lampadine di svincolo) sono state ben caratterizzate da tessuti post mortem e modelli sperimentali di degenerazione assonale, studio dei meccanismi molecolari alla base di questi processi dinamici è stato limitato. La maggior parte di questi studi si è basata su osservazioni endpoint statiche che non hanno di per sé di catturare singole risposte assonale nel tempo. Anche se esogeno applicate traccianti assonali sono stati utili a chiarire le risposte assoni dalle sezioni statiche e durante l&#39;imaging dal vivo, la disponibilità di marcatori assonale geneticamente codificati ha notevolmente migliorato la nostra capacità di visualizzare assoni in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infatti, un rapporto seminale da Kerschensteiner e colleghi prima ha fornito prova diretta di degenerazione assonale e rigenerazione in vivo utilizzando topi Thy1 GFP-S che codificano la proteina fluorescente verde in sottoinsiemi di neuroni che inviano le loro proiezioni nelle colonne dorsali del midollocavo 16. Immagini dal vivo utilizzando due approcci microscopia a scansione laser fotoni (TPLSM) e l&#39;etichettatura proteina fluorescente genetico delle cellule di interesse continua a fornire prove dirette e comprensione meccanicistica in molti diversi processi dinamici come la degenerazione assonale, Ca 2+ segnalazione, la rigenerazione assonale, astrociti fisiologia, la fisiologia della microglia, e la risposta al danno 17-25. In contrasto con gli assoni, si sa molto poco di risposte mielina al danno in tempo reale. La mielina è una componente vitale della materia bianca prodotta e mantenuta da oligodendrociti nelle cellule del sistema nervoso centrale e di Schwann nel PNS. Mielina isola 99% della superficie di assoni e così facendo fornisce una elevata resistenza, bassa capacità rivestimento protettivo che supporta rapida ed efficiente propagazione dell&#39;impulso saltatory, recentemente da Buttermore et al. 26. Per catturare la risposta dinamica di mielina al danno si usa il solvatochromic, lipofilacolorante fluorescente Nile Red 27. Le proprietà solvatochromic di questa macchia vitale permettono spostamenti spettrali del suo spettro di emissione che dipende sull&#39;ambiente fisico-chimica 28,29. Queste proprietà sono utili al fine di conoscere i meccanismi di danno axomyelinic e può essere osservata con dicroici adeguatamente selezionati e filtri di emissione o risolti usando la microscopia spettrale 27. Ad esempio, lo spettro di emissione di Nile Red è blu-spostata in ambienti meno polari, ricchi di lipidi, come quelli trovati in adipociti e normale mielina del SNC (picco di emissione ~ 580-590 nm) 27. Al contrario, i picchi dello spettro di emissione di questo colorante vitale a ~ 625 nm in endbulbs formate da assoni subiscono deperimento assonale 27. Anche se il preciso meccanismo questi spostamenti spettrali specificamente in endbulbs rispetto mielina normale rimangono poco chiari, tali cambiamenti spettrali possono rivelare le alterazioni alla base di accumulo di proteine ​​o la disorganizzazione che porta aesposizione dei idrofobiche siti di legame di 27. Mentre l&#39;imaging in vivo è la metrica fondamentale per l&#39;osservazione del midollo spinale dinamiche danno assonale nel loro ambiente nativo, è tecnicamente impegnativo e richiede competenza chirurgica notevole, e spesso ripetere ambulatori per esporre la colonna dorsale che può introdurre artefatti sperimentali (ad esempio, l&#39;infiammazione e la cicatrice formazione). Inoltre, le apparecchiature costose è spesso necessario per permettere la sospensione e il posizionamento di un animale intatta sotto la lente obiettivo microscopio. Gli animali devono essere attentamente monitorati e per assicurare che rimangono caldo, al fine di garantire i fluidi sono reintegrati, e per assicurarsi che non ci sono segni di ipossia a causa di sessioni di imaging anestetizzati prolungati. Quest&#39;ultimo è estremamente importante in quanto assoni e mielina assolutamente richiedono perfusione costante e livelli di ossigeno adeguati a rimanere vitale. Tuttavia, questo non è spesso segnalata o monitorato in più studi in vivo perdata. Inoltre, artefatti da movimento a causa della frequenza cardiaca e la respirazione (isoflurano anestetizzati topo adulto: ~ 300-450 battiti al minuto (BPM) è ottimale per mantenere la saturazione di ossigeno 97-98% (tasso normale di ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respiri al minuto (tariffa normale è ~ 163 respiri al minuto), rispettivamente)) 30 incontrato durante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopia a fluorescenza impegnativo come anche le scansioni laser più veloci inevitabilmente sono soggetti a questi movimenti artefatti. I progressi nella ultraveloci scanner di risonanza combinate con un impiantabile vertebrale rigida finestra incorniciate può consentire l&#39;imaging del midollo spinale murino in animali svegli, ma i tempi di scansione più veloce inevitabilmente ridurre il rapporto segnale rumore qualità dell&#39;immagine degradanti. Ulteriori miglioramenti nelle tecniche di imaging del midollo spinale, come attualmente utilizzate per l&#39;imaging cerebrale possono superare molti di questi ostacoli e di limitare le potenziali confonde introdotte dal inaperfusione tissutale dequate, ad esempio, 31-33. Molto di ciò che si conosce della sostanza bianca fisiologia e meccanismi di danno sostanza bianca è stato determinato utilizzando in vitro o ex vivo preparazioni di sostanza bianca dal nervo ottico, nervo periferico, e le strisce di midollo spinale sostanza bianca 34-41. Queste preparazioni continuano ad avanzare la nostra conoscenza dei meccanismi di lesioni bianche importa quanto consentono cambiamenti di fattori ambientali, controllata di farmaci e reagenti, valutazioni funzionali utilizzando elettrofisiologia, e dirette osservazioni microscopia a fluorescenza di assoni e mielina nel tessuto vivo controllati. Eppure, alcuni approcci precedenti per osservare assoni da midollo spinale strisce colonna dorsale o strisce di sostanza bianca ventrale inevitabilmente ferire assoni superficie durante la fase di rimozione che possono influenzare la risposta degli assoni strettamente opposti. Per capitalizzare le manipolazioni sperimentali di cui sopra e di evitare danni alla vefibre Ry sotto inchiesta, usiamo un modello del midollo spinale cervicale ex vivo in quanto impedisce il contatto diretto della parte dorsale del cavo. Così, l&#39;architettura della pia madre e adiacenti dorsali superficiali assoni colonna rimangono vitali e imperturbato durante l&#39;isolamento. Qui si descrive un approccio relativamente semplice che permette la visualizzazione diretta di assoni mielinizzati centrali come rispondono dinamicamente a una lesione focale in tempo reale fino a 8 - 10+ ore dopo l&#39;infortunio. La lesione del midollo spinale (Lisci) Modello indotta da laser consente la differenziazione tra i meccanismi di danno assonale primarie e secondarie, come la lesione primaria (sito di ablazione) rimane spazialmente vincolate nel tempo. La camera di imaging open-bagno è accessibile a un intervento terapeutico, la consegna dei reagenti, e manipolazioni ambientali. Agenti protettivi axomyelinic putativi possono essere rapidamente valutati in tempo reale da osservazioni dirette contro gli esperimenti lunghi e costosi che coinvolgono processi tessutoING, sezionamento, immunostaining, l&#39;acquisizione di immagini, e l&#39;analisi e quindi fornisce un modello utile surrogato per valutare le risposte acute e manipolazioni di protezione prima di testare gli agenti sperimentali di animali vivi.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Assoni SNC feriti non riescono a rigenerarsi e spesso ritrarre lontano dal luogo di ferita. Gli assoni risparmiati dalla lesione iniziale possono poi subire una degenerazione assonale secondaria. La mancanza di formazione cono di crescita, la rigenerazione, e la perdita di ulteriori proiezioni assonale mieliniche all&#39;interno del midollo spinale limita notevolmente il recupero neurologico dopo un trauma. Per valutare come centrale mielinizzati assoni del midollo spinale rispondono al danno, abbiamo sviluppato un modello ex vivo che vive midollo spinale utilizzando topi transgenici che esprimono la proteina giallo fluorescente in assoni e una focale e lesioni del midollo spinale indotta da laser altamente riproducibile per documentare il destino di assoni e mielina (colorante fluorescente lipofila Nile Red) nel tempo utilizzando la microscopia a due fotoni di eccitazione time-lapse. Processi dinamici come lesioni acute assonale, retrazione assonale e mielinica degenerazione sono meglio studiati in tempo reale. Tuttavia, la natura non-focale delle lesioni basate contusione-e artefatti da movimento rilevatodurante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopio impegnativo. Il modello in vivo ex midollo spinale descritto qui imita alcuni aspetti di rilevanza clinica contusione / patologie assonale compressione indotta tra cui gonfiore assonale, formazione sferoide, transezione assonale, e peri-assonale gonfiore fornendo un modello utile per studiare questi processi dinamici in tempo reale. I principali vantaggi di questo modello sono eccellenti risoluzione spazio-temporale che permette la differenziazione tra l&#39;insulto primario che danneggia direttamente gli assoni e dei meccanismi di lesioni secondarie; infusione controllata di reagenti direttamente al bagno perfusato il cavo; alterazioni precise del milieu ambientale (ad esempio, il calcio, ioni sodio, noti collaboratori di danno assonale, ma vicino impossibile da manipolare in vivo); e modelli murini offrono anche un vantaggio in quanto forniscono la possibilità di visualizzare emanipolare popolazioni di cellule geneticamente identificati e strutture cellulari. Qui, descriviamo come isolare e immagine vivente midollo spinale di topi per catturare dinamiche di danno assonale acuta.

Dettagli di un laboratorio appropriata stabilita necessarie per isolare, mantenere la vitalità, e l&#39;immagine del midollo spinale ex vivo è mostrato in Figura 1. Il microscopio deve essere dotato di un laser pulsato a femtosecondi accordabile, dicroics appropriati e filtri di emissione, e acqua immersione lente obiettivo con un elevato apertura numerica (≥1.0). Per garantire la redditività del midollo spinale durante la dissezione, la procedura deve essere eseguita in presenza di refrig...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Views.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis-indotta ischemia focale come un modello di lesioni del midollo spinale nei topi

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Medicina

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

Valutazione in tempo reale della microperfusione del midollo spinale in un modello suino di ischemia/riperfusione

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

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