This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

1. Gli esperimenti ChIP standard <ol><li> Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione. <ol><li> Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere tripsina-EDTA (1x) alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto. Raccogliere le cellule e lavare due volte con 10 ml di PBS. NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Procedere per contare le cellule. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg, scartare il surnatante e aggiungere 500 ml di PBS. Il numero ottimale di cellule per la fase di fissaggio è di 10 milioni di cellule per 500 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 13,5 ml di fresco 37% di formaldeide in ciascuna aliquota di 500 microlitri di sospensione cellulare. Fissare le cellule per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 57 ml di 1,25 M glicina solution per fermare la fissazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con miscelazione costante delicatamente vortice. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il supernatante senza disturbare il pellet di cellule. </li><li> Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Lisi cellulare e cromatina taglio <ol><li> Aggiungere 10 ml di ghiaccio di lisi freddo IL1 tampone al pellet (1 ml di tampone di lisi per 1 milione di cellule è il rapporto ottimale). Pipetta su e giù diverse volte e incubare per 10 min a 4 ° C con miscelazione delicata. </li><li> Centrifugare il lisato per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di tampone di lisi freddo ghiaccio IL2 ai lisati e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare i lisati per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. </li><li> Prepare il buffer tranciatura completa aggiungendo il 200x cocktail inibitore di proteasi (PIC) al buffer taglio IS1. Mantenere il buffer in ghiaccio per 5 min e lavorare in ghiaccio dopo. Aggiungere 1 ml di completo buffer di taglio IS1 a ogni 10 milioni di cellule pellet e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Prima sonicazione incubare i campioni in ghiaccio per 10 min per ridurre la viscosità del campione. </li><li> Al taglio di 300 aliquote microlitri di cromatina mediante ultrasuoni utilizzando un bagno di acqua sonicatore per 2 o 3 serie da 10 cicli ciascuno. Un ciclo consiste di 30 sec &quot;ON&quot; e 30 sec &quot;OFF&quot; in un ambiente ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione con un tempo più breve sonicazione 5 a 10 cicli di 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Brevemente vortex e girare i tubi tra le piste. Quando si utilizzano altri tipi di sonicatori, seguire le corrispondenti istruzioni del produttore per la cromatina taglio. </li><li> Centrifugare la cromatina tranciati a 16.000 xg per 10 min e collect il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro. </li><li> Analizzare l&#39;efficienza di taglio cromatina prima immunoprecipitazione passo con 1-1,5% gel TAE agarosio o bionalyzer. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. </li></ol></li></ol> 2. Basso Esperimenti chip Cell <ol><li> Raccolta delle cellule e DNA-proteine ​​reticolazione <ol><li> Crescere cellule HeLa-S3 ad una confluenza del 80% -90%. Rimuovere terreno di coltura, lavare il piatto due volte con 10 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS), e aggiungere 1x Tripsina-EDTA alla piastra di coltura. Incubare per un massimo di 2 min per staccare le cellule dal piatto. NOTA: più lunghi tempi di incubazione porterà a danni cellulari. </li><li> Raccogliere cellule aggiungendo 1 ml di mezzo di coltura contenente siero in una provetta centrifugazione 1 ml. Contare le cellule. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. Portare il numero di cellularea 10.000 cellule per ml di terreno di coltura per la fissazione. </li><li> Aggiungere 27 ml di 36,5% di formaldeide fresco preparato in ciascuna provetta per il fissaggio. Capovolgere il tubo due o tre volte e incubare 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 115 ml di soluzione 1,25 M glicina al campione, invertire il tubo due o tre volte e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Lavorare sul ghiaccio da questo punto in poi. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante lentamente. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di ghiaccio freddo HBSS con PIC (200x, concentrazione finale 1x). Capovolgere il tubo due o tre volte per risospendere le cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare delicatamente il surnatante e mantenere il pellet di cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Lisi cellulare e cromatina taglio <ol><li> Aggiungere 25 ml di tampone di lisi completa tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) per 10.000 cellule e agitare manualmente il fondo della provetta per risospendere le cellule. Incubare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Aggiungere 75 ml di completo HBSS (HBSS + PIC) tampone in ciascuna aliquota contenente 10.000 cellule. </li><li> Taglio aliquote di 100 microlitri di 10.000 cellule per ultrasuoni per 5 set di 5 cicli ciascuno. Un ciclo si compone di 30 sec &quot;ON&quot; e 30 sec &quot;OFF&quot; l&#39;impostazione ad alta potenza. In alternativa, utilizzare un dispositivo pico-sonicazione utilizzato con un tempo di sonicazione più breve di 5 cicli di 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. Si noti che i preparativi cromatina, tipi di cellule e diversi sonicatori richiedono esperimenti di ottimizzazione taglio separati. </li><li> Centrifuga la cromatina tranciati a 14000 g per 10 minuti a scartare il materiale insolubile e raccogliere il surnatante da utilizzare immediatamente nella fase IP. In alternativa, conservare la cromatina a -80 ° C per un massimo di 2 mesi per un uso futuro. </li><li> Analizzare l&#39;efficienza di taglio cromatina prima fase immunoprecipitazione utilizzando 1-1,5% TAE gel di agarosio oil bionalyzer. Campioni Trattare con RNase prima agarosio analisi gel al fine di migliorare la valutazione visiva di taglio. Ottime dimensioni frammento cromatina vanno da 100-600 bp. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprecipitazione della cromatina e Biblioteca Prep <ol><li> Per standard, automatizzato esperimenti ChIP <ol><li> Aggiungere 120 ml di chip di buffer H (ChIP Buffer H + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 2 ml a 20 ml, come campione di ingresso. </li><li> Selezionare il chip 200 microlitri protocollo automatizzato nello strumento di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa. </li><li> Eseguire un esperimento ChIP automatico utilizzando, cromatina pari a 1-2 milioni di cellule, 1-2 mg di anti-H3K79me3, grado -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e H3K9me3 ChIP-seq coniglio anticorpi policlonali. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda della modifica degli istoni e l&#39;affinità e specificity dell&#39;anticorpo corrispondente. <ol><li> Usare la stessa quantità di IgG di coniglio non immune da un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 20 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione. </li></ol></li><li> Utilizzare i istoni automatizzato reagenti ChIP-seq per effettuare esperimenti di ChIP automatizzate con anti-H3K79me3 e policlonali -H3K4me2. Utilizzare i reagenti del kit chip ss ideali per eseguire esperimenti chip anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3. </li><li> Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore. </li><li> Purificare il DNA inverso reticolato sul sistema automatizzato. Seleziona autprotocolli omated per la purificazione del DNA con un protocollo o un kit con magnetico purificazione del DNA basato tallone. Eluire il DNA in 25 ml di acqua. </li><li> Quantificare il DNA immunoprecipitato estraendo 10% del DNA immunoprecipitato. La resa DNA immunoprecipitato dipende dalla qualità della cromatina e anticorpi, tipo di cellula e la modifica di destinazione istoni. Quantificare il DNA utilizzando un kit di test secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare la qualità del DNA immunoprecipitato mediante PCR quantitativa utilizzando primer per almeno 1 positivo e 1 controllo negativo regioni genomiche. Non utilizzare più del 10% del DNA immunoprecipitato totale per valutare arricchimenti chip. <ol><li> Preparare le reazioni qPCR. Aggiungere 10 ml di una master mix 2x SyberGreen qPCR, 1 ml di miscela di primer, 1-5 ml di DNA immunoprecipitato o ingresso e acqua sterile fino a 20 ml di volume di reazione finale. Il programma qPCR prevede una fase iniziale di denaturazione a 95 ° Cper 5-10 minuti a seconda del fornitore della Taq polimerasi e le temperature di ricottura deve essere impostato secondo i primer selezionati. </li></ol></li><li> Utilizzare automatizzato protocolli biblioteca preparazione compatibili con i Illumina ChIP-seq reagenti preparazione biblioteca disponibili in commercio per costruire le librerie utilizzando sia ChIP DNA e il DNA di ingresso salvato dalla stessa preparazione cromatina. Utilizzare 10-20 ng di DNA immunoprecipitato da ciascun anticorpo per la preparazione libreria. Preparare fino a 16 librerie automatizzate per ciclo. </li><li> Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore Illumina. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo la Illumina conduttura, filtro standard e allineare la legge per l&#39;ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con l&#39;assetto ELAND. Utilizzare SICER 7 o MACS 8 per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle di cime wesimo Homer 9, BEDTools 10 o software preferito. </li></ol></li><li> Per numero automatizzato basso cellulari esperimenti ChIP <ol><li> Aggiungere 120 ml di tampone ChIP completa tC1 (ChIP Buffer tC1 + PIC) a 100 microlitri tranciate cromatina. Utilizzare 200 ml per la IP e mantenere 20 microlitri come input. </li><li> Selezionare automatizzato protocollo microlitri ChIP 200 nel sistema di automazione. La velocità del protocollo è da 1 a 16 campioni per corsa. </li><li> Eseguire un esperimento ChIP-seq automatizzato utilizzando reagenti ChIP automatizzati e anticorpi ChIP qualità ottimizzati per lavorare sulle quantità cromatina bassi. Utilizzare cromatina corrispondente a 10.000 cellule e 100.000 cellule, 0,5 mg di anti-H3K27me3, 0,25 mg -H3K4me3, 0.1 mg -H3K27ac, 0,25 mg -H3K9me3 grado anticorpi policlonali di coniglio ChIP-Seq Premium coniglio. Quantità ottimali di anticorpo variano a seconda modifica istoni e l&#39;affinità e specificità dell&#39;anticorpo corrispondente. <ol><li> Usare la stessa quantità di rab non immuneIgG bit come un anticorpo controllo isotipico. In alternativa, utilizzare perle non rivestiti o specifici anticorpi bloccato come controlli chip. Aggiungere 10 ml di proteina A sfere magnetiche rivestite per ogni reazione. </li></ol></li><li> Selezionare il protocollo ChIP automatico seguendo le istruzioni del software implementate nel dispositivo di automazione. Impostare i parametri sperimentali chip per 4 ore per la fase di rivestimento di anticorpi e 15 ore per il passo immunoprecipitazione. La fase di reticolazione inverso avviene nello strumento automatizzato a 65 ° C per 4 ore. </li><li> Purificare DNA reticolato inversa utilizzando le colonne di spin seguendo le istruzioni del produttore ed eluire in volumi da 6 ml a 25 ml di acqua. </li><li> Quantificare il DNA utilizzando un kit test commerciale. Analizzare i risultati per qPCR utilizzando primer per le regioni di controllo positivi e negativi per valutare la qualità chip. </li><li> Utilizzare un kit di preparazione biblioteca con reagenti preparazione di libreria ottimizzata per preparare librerie a basso quan DNAquan-. Utilizzare 30 pg e 300 pg di DNA chip (corrispondenti rispettivamente a 10.000 e 100.000 cellule esperimenti) per la preparazione biblioteca. Preparare le librerie che utilizzano il protocollo automatizzata compatibile con i reagenti di preparazione biblioteca. La libreria prep velocità automatizzata è 1 a 48 librerie per ciclo. </li><li> Dopo la riparazione fine dei modelli a doppia elica del DNA, legare gli adattatori stem-loop scindibili contenenti i siti di primer di sequenziamento. Dopo l&#39;estensione DNA passo, amplificare il campione con il metodo di amplificazione alta fedeltà descritto nel protocollo kit di preparazione biblioteca. </li><li> Dopo l&#39;amplificazione biblioteca, quantificare e purificare le librerie seguendo le indicazioni del kit di preparazione biblioteca. Si noti che la selezione del formato dopo purificazione non è necessaria. </li><li> Sequenza le librerie e generare cluster in base alle istruzioni del produttore. Eseguire bioinformatica primaria analisi (filtraggio cluster, chiamata di base, etc.) seguendo lo standard gasdotto produttore, il filtro, e allineare la legge per l&#39;ultimo gruppo di genoma umano (la versione corrente è GRCh38) con la ELAND 7 mascherina. Utilizzare SICER 8 o MACS 9 per il picco di chiamata ed effettuare le analisi a valle dei picchi con Homer, BEDTools 10, o qualsiasi software preferito. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig1highres.jpg" /> Figura 1. Screenshots del software che mostra come impostare esperimenti ChIP automatizzata nel PI-Star Compact. Il software offre la flessibilità di selezionare la quantità di campioni per periodo e per modificare i parametri sperimentali chiave (Anticorpo Coating, IP e lavaggi ) secondo le esigenze ricercatore. La procedura automatizzata consente testare diverse condizioni in parallelo (vale a dire, diversi tipi e le quantità di anticorpi, diversi tipi e le quantità di cellule e persino diversi tipi e quantità di sfere magnetiche nello stesso periodo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52150/52150fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig2highres.jpg" /> Figura 2. Schermate del software che mostra come impostare la preparazione automatizzata libreria per sequenziamento di nuova generazione utilizzando il kit biblioteca nel sistema di automazione. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52150/52150fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

Immunoprecipitazione della cromatina seguita dal sequenziamento è ormai una procedura standard. Qui un protocollo ChIP-seq automatizzata in grado di generare profili epigenetici cromatina con solo 10.000 cellule del materiale di partenza è presentato. Automatizzare Chip e preparazione biblioteca test consente la standardizzazione della procedura di ottimizzazione di chip e ridurre la variabilità sperimentale. Il sistema di gestione dei liquidi presentato qui elimina molte delle procedure manuali associati ChIP riducendo le mani in tempo per appena 30 minuti, riduce al minimo la perdita di campione, e consente accurate ChIP-seq con pochi picogrammi di ingresso biblioteca. Al fine di raggiungere gli esperimenti riusciti ChIP-seq automatizzati, è anche fondamentale utilizzare di alta qualità preparati cromatina tranciati e anticorpi grado ChIP-seq in ogni esperimento Il sistema utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e offre flessibilità per modificare i principali parametri sperimentali come incubazione tempo per il cappotto anticorpiing e passaggi di immunoprecipitazione o modifica delle condizioni di lavaggio che consentono al ricercatore di condurre tutti gli esperimenti necessari per l&#39;ottimizzazione ChIP-seq. Il sistema automatizzato è una piattaforma &quot;aperta&quot; che permette anche il confronto di più reagenti in parallelo per l&#39;ottimizzazione delle condizioni sperimentali per ciascuna linea cellulare individuale e anticorpi e consente un confronto diretto dei vari tipi e concentrazioni di cromatina, anticorpi diversi e anche diversi tipi di magnetica perline. Uno dei limiti del sistema automatizzato è la necessità di automatizzare tutti i protocolli in volumi che vanno da 5 microlitri di 200 microlitri. Tuttavia, la miniaturizzazione degli esperimenti in questa piattaforma automatizzata consente inoltre di risparmiare sui costi di reagenti. Oltre ai protocolli descritti in questo studio, il sistema è adattabile e anche automatizza una varietà di altre applicazioni basate branello magnetico come un immunoprecipitazionend cattura di DNA metilato (tecnologie MeDIP e MethylCap), immunoprecipitazione di DNA hydroxylmethylated (hMEDIP), immunoprecipitazione della cromatina sequenziale (ReChIP), RNA immunoprecipitazione (RNA-IP), la conversione bisolfito, e saggi di purificazione del DNA.

Come Next-Generation Sequencing (NGS) le tecnologie si sono diffuse e più accessibile, il metodo principale per la mappatura a livello di genoma di interazioni proteina-DNA è ora cromatina seguito da NGS rilevamento (ChIP-seq), che permette la scoperta del fattore di trascrizione siti o modelli di modificazioni degli istoni vincolanti. ChIP-seq è vantaggiosa nel fornire dati ad alta throughput dell&#39;intero genoma che può essere utilizzato per l&#39;analisi quantitativa e qualitativa delle interazioni proteina-DNA mediante la misura dei frammenti di DNA arricchito. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in esperimenti ChIP-seq standard come la difficoltà di ottenere abbastanza materiale per creare una libreria sequenziamento. Esperimenti ChIP sono divisi in sei fasi fondamentali, tra cui le regioni di legame 1) reticolazione proteina-DNA 2) la preparazione del campione, che include la lisi cellulare e taglio della cromatina mediante ultrasuoni, 3) la formazione degli immunocomplessi,4) precipitazione dei immunocomplessi, 5) lavaggio delle immunocomplessi, e 6) eluizione del materiale arricchito e analisi qPCR e NGS. Il successo di un saggio ChIP dipende da tre fattori principali: una buona preparazione cromatina, la quantità di antigene nel campione originale, e la specificità e affinità dell&#39;anticorpo per il suo antigene affine. Una limitazione importante è il requisito di elevate quantità di partire numero di cellule per ottenere abbastanza DNA arricchito per creare una libreria sequenziamento. Per gli scienziati che lavorano con quantità di campione limitati, quali biopsie o di cellule sotto-popolazioni, esperimenti di ChIP-seq sono molto impegnativo. Recenti studi hanno dimostrato che saggi ChIP-seq possono essere eseguite quando si lavora con una bassa quantità di celle 1, 2. Diagenode ha sviluppato un sistema di manipolazione robotizzato liquido che può automatizzare completamente esperimenti ChIP-seq quando iniziano con un numero limitato di cellule. Automation forniscemolti vantaggi rispetto preparazione manuale dei campioni di chip-ss quanto diminuisce errore umano, riduce la variabilità, e riduce il costo sperimentale. Sono stati riportati i protocolli semi-automatico per cromatina e la preparazione biblioteca, ma nessuno di questi studi ha mostrato dati quando si utilizza il numero di cellule bassi 3, 4, 5, 6. In questo documento un flusso di lavoro completo automatizzato è descritto sia per immunoprecipitazione e preparazione biblioteca saggi cromatina in un sistema di trattamento del liquido robot che utilizza la tecnologia basata bead-magnetico e che può risolvere diversi parametri di ottimizzazione del protocollo. Qui, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti con successo su un numero limitato di cellule con l&#39;obiettivo di semplificare, standardizzare, e fornendo una soluzione affidabile per studiare profili epigenetici in popolazioni piccole cellule. Il protocollo ChIP automatizzato descritto in questo documento è stato ottimizzato su cellule HeLa utilizzando specifici anticorpi istoni e reagenti but il flusso di lavoro può essere adattato ad altre linee cellulari e anticorpi con corrispondenti ottimizzazione sperimentale.

<table><tbody><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td></td></tr><tr><td>1.25 M Glycine Solution</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td></tr><tr><td>Lysis Buffer iL1</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td></tr><tr><td>Lysis Buffer iL2</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td></tr><tr><td>Shearing Buffer iS1</td><td>Diagenode</td><td>C01020010</td><td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td></tr><tr><td>Protease Inhibitors Mix (200x)</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td></tr><tr><td>HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td><td>Life technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer tL1</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td></tr><tr><td>ChIP Buffer tC1</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td></tr><tr><td>ideal ChIP-seq kit</td><td>Diagneode</td><td>C01010051</td><td></td></tr><tr><td>ChIP-Buffer H</td><td>Diagenode</td><td>C01010020</td><td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td></tr><tr><td>Auto Histone ChIP-seq kit</td><td>Diagenode</td><td>C01010020</td><td></td></tr><tr><td>Auto True Micro ChIP kit</td><td>Diagenode</td><td>C01010130</td><td></td></tr><tr><td>H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td><td>Diagenode</td><td>C15310068</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td><td>Diagenode</td><td>C15410069</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td><td>Diagenode</td><td>C15410030</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td><td>Diagenode</td><td>C15410035</td><td></td></tr><tr><td>H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410004</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410200</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410058</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td><td>Diagenode</td><td>C15410193</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Protein-A coated paramagnetic beads</td><td>Diagenode</td><td>C01010020</td><td></td></tr><tr><td>Auto IPure</td><td>Diagenode</td><td>C03010010</td><td></td></tr><tr><td>MicroChIP DiaPure columns</td><td>Diagenode</td><td>C03040001</td><td></td></tr><tr><td>Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml</td><td>Diagenode</td><td>DMMLD2D100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Quant-IT dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td><td>Illumina</td><td>FC-121-3001</td><td></td></tr><tr><td>Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td></td></tr><tr><td>MicroPlex Library Preparation Kit</td><td>Diagenode</td><td>C05010010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Library prep Quantification kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4844</td><td></td></tr><tr><td>IP-Star Compact&amp;nbsp; Automated System</td><td>Diagenode</td><td>B03000002</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico</td><td>Diagenode</td><td>B01060001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit system</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Hiseq systems</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Ottimizzazione esperimenti ChIP-seq automatizzati per otto diversi marcatori degli istoni Al fine di sviluppare con successo e validare i protocolli ChIP automatizzati, anticorpi grado ChIP-Seq precedentemente convalidati in esperimenti di ChIP-Seq manuali (dati non riportati) sono stati selezionati. I seguenti anticorpi grado ChIP-seq sono stati scelti per questo studio: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3. La specificità di tutti gli anticorpi grado ChIP-seq è stato già confermato dalla macchia puntino, array di peptidi e gli esperimenti Western Blot (dati non riportati). Esperimenti pilota ChIP-qPCR con quantità crescenti di anticorpi sono stati eseguiti per determinare la sensibilità degli anticorpi (Figura 3). qPCR con almeno due positive e due obiettivi di controllo negativi sono stati analizzati e profili con arricchimenti di positivo oltre bersaglio negative superiori a cinque volte sono qualificati per il sequenziamento exper<html> iments. E &#39;importante eseguire esperimenti Chip e ChIP-Seq con un&#39;alta qualità della cromatina tranciati. Tutti gli esperimenti ChIP riportati in questa pubblicazione sono stati eseguiti utilizzando cromatina fresco. È anche possibile congelare le cellule fissate a -80 ° C e procede all&#39;elaborazione cromatina e tranciatura in un giorno diverso. Tuttavia, cromatina preparato da cellule fissate congelate possono comportarsi in modo diverso da cromatina preparati al momento e quindi le condizioni di sonicazione può avere bisogno di essere ottimizzato per ogni preparazione cromatina. Quando si lavora con diversi tipi cellulari, possono essere utilizzati i buffer di tranciatura con differenti composizioni detergenti (SDS). Tipi cellulari, quali linee cellulari primarie o cellule coltivate in sospensione sono cellule difficili da taglio e richiederanno di alte concentrazioni di SDS (1%), mentre le linee cellulari che sono facili da taglio come HeLa richiederà basse concentrazioni SDS (0,1%) nel buffer di taglio. res.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Validazione di anticorpi ChIP qualità utilizzando il sistema di automazione. ChIP è stata eseguita con l&#39;anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 e -H3K9me3 anticorpi policlonali di coniglio su cromatina tosata da 1 milione di cellule HeLa-S3 seconda delle modificazioni degli istoni. Protocolli ChIP automatizzati con volumi di lavoro 200 microlitri sono stati utilizzati nello strumento di automazione per gli esperimenti di titolazione degli anticorpi. Anticorpo quantità di 1, 2, 5 e 10 mg sono state testate per esperimento ChIP e 2 mg di IgG sono stati usati come controllo negativo in ogni esperimento. Arricchimenti sono stati valutati mediante qPCR. I risultati sono mostrati in% di ingresso (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo l&#39;analisi qPCR). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo la convalida e la determinazione optima<html> l quantità di anticorpi ChIP qualità da utilizzare nel sistema di automazione, esperimenti ChIP-seq automatizzati sono stati eseguiti per generare profili di sequenziamento per ciascuna modifica istoni (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> Figura 4. istone profili ChIP-seq generati da esperimenti di ChIP-seq automatizzati. La figura mostra i profili ChIP-seq in diverse regioni genomiche per H3K4me3, H3K9ac e H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 e H3K36me3. 4A mostra la distribuzione picco lungo l&#39;intero X -chromosome e 4B la distribuzione in una regione di 75 kb circostante il gene GAPDH. 4C mostra i profili di H3K27me3, H3K36me3 e H3K4me3 in una regione 500 kb circostante il gene MYT1 e 4D mostra la distribuzione di H3K9me3 in un ZNF12 circostante 200 kb regione.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Istoni profili epigenetici per sei diverse modificazioni degli istoni associati con l&#39;espressione genica sono stati generati (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 e H3K36me3). La figura 4A mostra profili ChIP-seq lungo il cromosoma X per i diversi marcatori degli istoni. La correlazione altamente picco osservato tra i 6 differenti profili istoni indica le capacità del sistema automatizzato per generare dati precisi e affidabili. Figura 4B, 4C e 4D mostrano la distribuzione dei picchi di diverse modificazioni degli istoni in specifiche regioni genomiche. Automatizzati esperimenti cromatina immunoprecipitazione giù a 200 cellule La quantità minima di cellule che possono essere utilizzati in esperimenti di ChIP dipende dalla qualità della cromatina, la specificity e la sensibilità degli anticorpi e l&#39;abbondanza della modifica degli istoni o proteine ​​studiate. Selezione buone anticorpi grado ChIP-seq è importante quando si lavora con quantità limitate di campione e la selezione dei reagenti ottimali e diversi vettori migliora l&#39;efficienza del recupero di DNA e contribuire al successo dell&#39;esperimento chip. Per determinare l&#39;importo minimo di cellule che il protocollo ChIP automatizzato in grado di elaborare, diverse quantità di cromatina, anticorpi, e sfere magnetiche sono stati testati nel sistema automatizzato IP-Star utilizzando reagenti ChIP specificamente ottimizzati per funzionare con basse quantità di cromatina. Innanzitutto, cromatina da 10.000 cellule è stato sonicato come descritto nel protocollo. I risultati sono stati confermati da ChIP qPCR (Figura 5A) che mostra arricchimenti significativi con H3K4me3 anticorpi nelle regioni di controllo positivo e il segnale trascurabile nelle regioni di controllo negativo. Per il confronto e la prova di coerenza, additionadati ottenuti con l H3K27ac, H3K9me3, e anticorpi H3K27me3, con 10.000 cellule è fornito. Esperimenti ChIP automatizzati sono stati eseguiti poi per dimostrare le capacità del sistema automatizzato per lavorare con basse quantità di celle utilizzando lo stesso anticorpo H3K4me3. Il chip automatizzato eseguito bene, dimostrata da una serie di dieci reazioni IP che erano riproducibili e altamente paragonabili ai risultati ChIP manuali (Figura 5B). Esperimenti manuali e automatizzati sono stati eseguiti e benefici dei protocolli automatici sono stati visti nel ridurre esperimento per sperimentare la variabilità (Figura 5C). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> Figura 5. Ottimizzazione del chip e Auto ChIP esperimenti su 10.000 cellule sono stati eseguiti esperimenti di ChIP manuali su 10.000 cellule e con 0,25 mg di H3K4me3, 0,1 mg di H3K27ac, 0,5 mg di H3K9me3 e 0,25 mg di anticorpi H3K27me3. Quantitativi identici di IgG di coniglio sono stati usati come controllo. La qPCR è stata eseguita con primer per due loci positive e due loci negativo per ogni saggio ChIP. La Figura 5A mostra il recupero, espressa come percentuale di input (la quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo analisi qPCR). Figura 5b mostra 10 reazioni ChIP eseguiti sul IP-Star Compact con 0,25 mg H3K4me3 policlonale e 0,25 mg di IgG di coniglio anticorpo di controllo come negativo. Poi è stata effettuata l&#39;analisi qPCR con primer per il positivo promoter loci EIF4A2 e GAPDH TSS e il negativo exon2 loci mioglobina e Sat2. La figura mostra il recupero, espressa come percentuale di ingresso (quantità relativa di DNA immunoprecipitato rispetto all&#39;ingresso del DNA dopo analisi qPCR). La Figura 5C illustra dati H3K4me3 piastrina di 10 esperimenti ChIP manuali in confronto al 10 esperimenti ChIP automatizzati. Barre di errore rappresentano s<html> deviazioni tandard di ciascuna delle dieci repliche. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per comprendere la sensibilità dei protocolli ChIP automatizzati, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una quantità di cellule che variava da 100.000 fino a 200 cellule per IP. L&#39;anticorpo anti-H3K27me3 stato usato in quanto è una modifica molto comune istoni. L&#39;uso di altri anticorpi istone o non-istoni può richiedere cellule più o meno, a seconda l&#39;abbondanza dell&#39;epitopo e la qualità dell&#39;anticorpo. Gli esperimenti sono stati convalidati mediante PCR quantitativa e si è osservato che, riducendo quantità di perline e sfondo anticorpi negli esperimenti è ridotto permettendo successo risultati ChIP-qPCR con soli 200 cellule anticorpo (Figura 6). iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. automatizzato test chip su 200 cellule. Cellule Hela-S3 e anticorpi diretti contro H3K27me3. La cromatina è stata tosata da 1 milione di cellule e diluizioni seriali di questo cromatina (da 100.000 a 200 equivalenti cellule) sono stati utilizzati per reazione chip. 1 mg di H3K27me3 e 10 ml di proteine ​​sfere magnetiche A rivestite sono stati utilizzati in esperimenti 100.000 cellule, 0,5 mg di H3K27me3 e 10 ml di perline su 10.000 e 1.000 celle, e 0,25 mg di H3K27me3 e 5 ml di perline con 500 e 200 cellule. 1 mg e 0,5 mg di IgG di coniglio sono stati utilizzati come anticorpo di controllo negativo durante l&#39;esecuzione di esperimenti con 100.000 celle e 1.000 cellule rispettivamente. 6A mostra l&#39;occupazione di TSH2B e GAPDH geni in% su ingresso. 6B mostra occupazione relativa del TSH2B rispetto ai controlli GAPDH negativo regione genomica. Analisi valle dei risultati ChIP-seq su10.000 cellule Al fine di valutare la qualità globale degli esperimenti ChIP-seq automatizzato con i numeri di partenza bassi di cellule, automatizzati sono stati eseguiti saggi ChIP-seq con 0,25 mg dell&#39;anticorpo H3K4me3 su 10.000 cellule HeLa ed esperimenti Chip On sono stati utilizzati 100.000 cellule HeLa-S3 come controllo positivo per l&#39;esperimento. Le librerie automatizzate sono state utilizzate le biblioteche Microplex kit di preparazione reagenti adeguati alle biblioteche preparati con basse quantità di DNA. Si noti che, anche se è possibile eseguire con successo chip esperimenti automatizzati con meno di 10.000 cellule, gli importi dei tirato giù DNA non saranno sufficienti per preparare librerie utilizzando i reagenti del kit. Generazione Cluster e sequenziamento sono stati eseguiti secondo le istruzioni del produttore. La bioinformatica analizza dopo i sequenziamento mostrano ottimi risultati a partire dal numero di cellule campioni a bassa chip. Il set di dati 30 pg (corrispondenti a 10.000 cellule del materiale di partenza<html> ) Contengono basso rumore di fondo e picchi di arricchimento altamente affidabili confermati sia dal 300 pg dataset (corrispondenti a 100.000 cellule del materiale di partenza) e il set di dati H3K4me3 generato dal Broad Institute del progetto ENCODE che è stato utilizzato come riferimento esterno. È importante notare i dati Top rapporto di sovrapposizione 40, che si riferisce ad un metodo standard utilizzato nel progetto ENCODE 11, in cui il chip-seq è considerata riproducibile se si confrontano i due insiemi di dati esiste almeno una sovrapposizione 80% dei migliori 40% dei picchi ordinati per punteggio significato. Il set di dati di 30 pg soddisfa questi criteri rispetto sia al 300 pg dataset (considerando tutte le sue vette, non solo il migliore del 40%) ei dati Broad Institute (Tabella 1). Il set di dati di 300 pg mostra picchi quasi identici ai dati Broad Institute con Top rapporto di sovrapposizione 40 98% (Figura 7). ighres.jpg &quot;/&gt; Figura 7. saggi Chip e generazione biblioteca 10.000 cellule esperimenti ChIP-seq sono stati generati su 10.000 e 100.000 cellule HeLa-S3 utilizzando H3K4me3 anticorpi (0,25 mg / mL). Le 35 etichette bp sono stati mappati al genoma umano con la mascherina ELAND. Durante la successiva picco chiamando SICER potrebbe attendibilmente identificare i arricchimenti dal numero di cellule bassi così come da milioni di cellule. I set di dati sono stati analizzati e confrontati tra loro e ai dati di riferimento generati dal Broad Institute. I campioni di cellule bassi sono coerenti e abbia una grande somiglianza. Il campione 30 pg soddisfa il criterio ENCODE 11 (min. 80% della top 40% dei picchi deve sovrapporsi). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> Tabella 1. </strong&gt;

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Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Video: Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

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A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

Una combinatoria unicellulare approccio per la caratterizzazione molecolare e Immunophenotypic eterogeneità del tronco umano e popolazioni di cellule progenitrici

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Genetica

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic marks in a single cell and requiring data from other cells to distinguish signal from experimental background noise in a single cell. This paper describes a method to reuse the same single cell for iterative epigenomic analyses. 
In this experimental method, cellular proteins are first anchored to a polyacrylamide polymer instead of crosslinking them to protein and DNA, alleviating structural bias. This critical step allows repeated experiments with the same single cell. Next, a random primer with a scaffold sequence for proximity ligation is annealed to the genomic DNA, and the genomic sequence is added to the primer by extension using a DNA polymerase. Subsequently, an antibody against an epigenetic marker and control IgG, each labeled with different DNA probes, are bound to the respective targets in the same single cell. 
Proximity ligation is induced between the random primer and the antibody by adding a connector DNA with complementary sequences to the scaffold sequence of the random primer and the antibody-DNA probe. This approach integrates antibody information and nearby genome sequences in a single DNA product of proximity ligation. By enabling repeated experiments with the same single cell, this method allows an increase in data density from a rare cell and statistical analysis using only IgG and antibody data from the same cell. The reusable single cells prepared by this method can be stored for at least a few months and reused later to broaden epigenetic characterization and increase data density. This method provides flexibility to researchers and their projects.

The present protocol describes a single-cell method for iterative epigenomic analyses using a reusable single cell. The reusable single cell allows analyses of multiple epigenetic marks in the same single cell and statistical validation of the results.

Singola cellula riutilizzabile per analisi epigenomiche iterative

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

Ottimizzazione ATAC-Seq per la ricerca sull'epigenetica del cancro

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Biologia

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioingegneria

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...