Gli autori ringraziano Tom Robinson per la lettura delle bozze del manoscritto, C. Bärtschi e H. Benz per la realizzazione del sistema di controllo della pressione custom-built. Vorremmo inoltre ringraziare l&#39;uso della funzione stanza pulita prima e la microscopia ottica Center (LMC), sia presso l&#39;ETH di Zurigo. Il lavoro è stato finanziato dalla Merck Serono e dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell&#39;ambito del 7 ° Programma Quadro (ERC Starting Grant, progetto n. 203.428, nμLIPIDs).

1. SU-8 master Fabrication Preparare entrambe stampi principali per i canali (fluidici e di controllo, per schemi e dimensioni vedere Figura 2) con il seguente protocollo ma con differenti modelli di maschera. Il processo è mostrato nella figura 3a. <ol><li> Inizia riscaldando un wafer di silicio da 4 pollici per 10 min a 180 ° C. Caricare il wafer disidratato in uno spin-torre di verniciatura e utilizzare il seguente protocollo per spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Spin wafer a 100 rpm per 20 sec (coperchio aperto di spin-coater, dispensare SU-8 durante questa fase, chiudere il coperchio dopo la dispensazione). </li><li> Spin wafer a 500 rpm per 10 sec (estenderebbe l&#39;resistere sull&#39;intero wafer). </li><li> Spin wafer a 1.750 rpm per 30 sec (definisce l&#39;altezza del resist a 20 micron). </li></ol></li><li> Rimuovere resistere dal bordo del wafer con acetone (utilizzare un tampone) poiché ciò altrimenti aderire alla piastra nella fase successiva. Trasferire il wafer ahotplate a 95 ° C e calore per 4 min. Dopo la softbake, esporre il resist attraverso un fotomaschera attaccata al vetro sodalime in un allineatore maschera con luce UV (150 mJ / cm 2, misurata a 365 nm). </li><li> Dopo l&#39;esposizione, riscaldare il wafer di nuovo a 95 ° C per 5 min su una piastra. Raffreddare il wafer di RT e poi immergerlo in un bagno di SU-8 sviluppatore per 4 min. Agitare delicatamente per rimuovere impressionate SU-8. Lavare il wafer con clean-room grado isopropanolo e asciugare con azoto. Controllare al microscopio se lo sviluppo ha avuto successo (soprattutto le trappole cellulari). Se le trappole cellulari sono completamente sviluppati, il riflesso del wafer di silicio dovrebbe essere visibile. Se necessario, sviluppare nuovamente il wafer per alcuni minuti. </li><li> Cuocere il wafer in stufa per 2 ore a 180 ° C per rimuovere tutto il solvente residuo. Controllare l&#39;altezza dei canali con un profiler passo. Se l&#39;altezza differisce dalla altezza desiderata, ripetere questo protocollo partendo dal punto 1.1 con una nuova wafer ecambiare lo spin-velocità (fase 1.1.3). Finalizzare la fabbricazione di stampo master silanizzante la cialda con 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silano in un essiccatore durante la notte. </li></ol> 2. Fabrication Master stampa microcontact <ol><li> Per preparare maestri stampi per la stampa microcontact, disidratare un wafer di silicio per 10 min a 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS su questo wafer a 7.500 rpm per 30 sec (resist aderisce meglio alla superficie silanizzata). Spin-cappotto 2 ml di AZ1518 positivo resistono con questo protocollo: <ol><li> Erogazione statica del resist al wafer. </li><li> Spin wafer per 5 secondi a 500 giri al minuto. </li><li> Spin wafer per 60 sec a 4000 giri. </li></ol></li><li> Dopo un secondo softbake 50 a 100 ° C su una piastra, esporre il resist di luce UV (21 mJ / cm 2 a 365 nm) attraverso una fotomaschera ed un allineatore maschera. Sviluppare il resist in un bagno di AZ 726 per 75 sec. Sciacquare il wafer sviluppato con acqua demineralizzata e colpo dry con azoto. Rimuovere il solvente residuo riscaldando il wafer a 115 ° C per 50 sec. Silanizzazione wafer sottovuoto durante la notte. </li></ol> 3. Realizzazione della Microfluidic Chip Un disegno dispositivo a due strati viene utilizzato per questi esperimenti. I due strati sono preparati separatamente e sono legati insieme, prima che il chip viene finalmente incollato su un vetrino (Figura 3b). Questo passaggio descrive la produzione dei PDMS strati e il timbro PDMS per la stampa microcontact. <ol><li> Preparare una miscela di PDMS 10:01 e agente indurente. Preparare circa 80 g di PDMS in totale (usando le nostre idee, questo si tradurrà in 10 gettoni). Mescolare le due parti vigorosamente e degassarla PDMS finché il composto è bolla libera (~ 30 min). </li><li> Posizionare il wafer con lo strato di controllo all&#39;interno di una capsula di Petri e nastro sul fondo. Successivamente, versare ~ 50 g di PDMS sulla parte superiore e mettere il wafer per almeno 2 ore in un forno a 80 ° C per assicurare la completaindurimento delle PDMS. Ripetere la stessa procedura per il wafer stampa microcontact, per questo è necessario ~ 20 g PDMS. </li><li> Spin-coat PDMS sul wafer con lo strato fluidico ad una velocità di rotazione di 2.000 rpm per formare uno strato di circa 40 micron alta PDMS. Curare le PDMS in un forno per almeno 1 ora a 80 ° C. </li><li> Quando entrambe le parti sono guariti, rimuovere lo strato di controllo dal wafer e tagliato a pezzi con una lama di rasoio. Perforare connessione pressione utilizzando una biopsia perforatore ad 1 mm. Per lo stoccaggio, si consiglia di mettere un pezzo di nastro sui canali. </li><li> Per legare i due strati, prendere l&#39;ostia spin-rivestito e la parte superiore e metterli in un pulitore del plasma 23. Dopo il trattamento al plasma, allineare rapidamente entrambe le parti sotto un microscopio con grande distanza di lavoro. Aggiungere alcuni pezzi di PDMS intorno alle parti superiori collocati. Questo passaggio non è obbligatorio, tuttavia facilita la rimozione dei PDMS dal wafer. Posizionare il wafer in un forno a 80 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Utilizzare un bisturi per rimuovere con attenzione le PDMS dal wafer e tagliare i microchip. Punch fori di accesso per i collegamenti fluidici con biopsia perforatore 1,5 millimetri. </li><li> Il chip PDMS è terminata e può essere conservato per mesi. Facoltativo: Se il chip è utilizzato con un serbatoio, tagliare la parte superiore di una punta di pipetta 200 microlitri e utilizzare alcune ricambio, PDMS semi-indurito per incollarla sopra. Mettere il chip in forno nuovamente a 80 ° C per almeno 1 ora. </li></ol> 4. Bonding per vetrino Per utilizzare il dispositivo per saggi enzimatici diretti, l&#39;unico passo necessario dopo l&#39;incollaggio è il blocco di superfici. Per questo protocollo, procedere ad A. Tuttavia, per utilizzare il chip microfluidica per test immunologici o ELISA, si prega di fare riferimento al protocollo B per limitare i siti di legame solo al vetrino (vale a dire per la microscopia TIRF o SPR). Se questa limitazione non è importante, fare riferimento ad A, ma utilizzare coniugati biotinilato in fase 4.3 e continuare con la fase 4.8nel protocollo B per creare una superficie completamente funzionale. Prima di eseguire protocollo A e B: Si consiglia di filtrare tutte le soluzioni proteiche utilizzato prima di introdurli nel chip. Detriti e aggregati proteici possono altrimenti bloccare trappole cellulari, riducendo così il numero di camere che possono essere utilizzati per l&#39;analisi. A questo scopo, utilizzare un nonprotein unità filtro assorbente per filtrare tutte le soluzioni prima di introdurli nei canali. Protocollo A (saggi enzimatici) <ol><li> Per finalizzare il dispositivo microfluidica, legare le parti PDMS su un vetrino. Per fare questo, prima pulire un vetrino con sapone, acqua distillata ed etanolo. Essiccare vetrino utilizzando un flusso di azoto. Pulire la parte PDMS con lo scotch. </li><li> Mettere la parte PDMS e il vetrino pulito nel pulitore plasma per 45 sec a 18 W. Per garantire un legame stretto, mettere il chip su una piastra calda (100 ° C) per 5 min. </li><li> Dopo l&#39;incollaggio, riempire il chip con fLUID. Un modo semplice per raggiungere questo obiettivo è quello di utilizzare la forza centrifuga. Tagliare la parte inferiore della punta di 200 microlitri pipetta. Per i canali fluidici, riempirli con la soluzione di saturazione (albumina di siero bovino (4% w / v) o poli-L-lisina) glicole polietilene innestato (0.05% w / v) e posizionare le punte nelle prese. Riempire le insenature livello di controllo con acqua o con una soluzione isosmotic, ad esempio PBS. Posizionare il chip nella centrifuga (800 xg) per 5 min. I canali dovrebbero essere ora pieni di liquido completamente. In caso contrario, ripetere questo passaggio. </li><li> Incubare la soluzione di saturazione per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare la soluzione di strato di fluido con PBS ad una portata di 10 microlitri / min utilizzando una pompa a siringa. Il dispositivo è ora pronto per esperimenti sulle cellule. </li></ol> Protocollo B (i dosaggi) Per una panoramica completa della modifica della superficie dal punto 4.7 in poi, si prega di fare riferimento alla Tabella 1. <ol start="5"><li> InPDMS cubate Stamp per la stampa microcontact con una soluzione bBSA / BSA (es 1-100). Dopo 30 min, pulire i francobolli accuratamente con acqua distillata e asciugare il timbro in corrente di azoto. Introdurre rapidamente i francobolli su un vetrino pulito (Figura 4). </li><li> Esporre il vetrino con il timbro insieme alla parte superiore del chip microfluidica di plasma di ossigeno per 45 sec a potenza massima (18 W) e un detersivo plasma. Dopo il trattamento al plasma, rimuovere il timbro e allineare la superficie stampata sotto le microchambers del dispositivo. Posizionare il chip per 30 min su una piastra calda a 50 ° C. </li><li> Per bloccare la rimanente superficie, introdurre soluzione filtrata sterile BSA (4% (w / v) in PBS) nel chip con una centrifuga (vedi fase 4.2). Incubare per 1 ora e lavare la soluzione fuori dello strato di fluido con PBS (vedi passo 4.3). Il chip può essere utilizzato direttamente o conservata fino a 2 settimane a 4 ° C in un contenitore umido. </li><li> Per un tensioattivo vincolante completamente funzionalee, introdurre avidina (0,025% (w / v) in PBS) nel serbatoio. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per 30 min a ritirare la soluzione avidina attraverso i canali del fluido. Successivamente, lavare PBS per 10 min. Sciacquare accuratamente il serbatoio. </li><li> Successivamente, aggiungere proteine ​​G (0,0025% (w / v) in PBS) e filo per altri 30 min. Lavare con PBS per altri 10 min dopo. Successivamente, aggiungere l&#39;anticorpo di interesse (0,0001% (w / v) in PBS) per 10 min. Dopo 10 minuti, fermare il flusso per 15 minuti per consentire il legame. Successivamente, lavare con PBS per 10 min. </li></ol> 5. Esperimenti cellulari Il protocollo è scritto in termini generali, a causa della varietà di possibili saggi. Come esempio i reagenti necessari per il saggio di tossicità G6PDH sono dati. La cella cattura efficienza iniziale del dispositivo è di circa 2,5%, vale a dire 5 di 200 cellule saranno intrappolati. L&#39;occupazione finale delle trappole cellula dipende fortemente dalla linea cellulare utilizzata, il protocollo di sospenderela linea cellulare e il tempo le cellule sono irrigati attraverso il canale. Per le cellule naturalmente crescono in sospensione (ad esempio U937), singole cellule possono essere trovati in circa il 75% delle camere dopo pochi minuti. Le altre camere non sono o pieni, o occupati da due o più celle. In generale, l&#39;occupazione cella singola è minore per linee cellulari aderenti. Quando si utilizza il protocollo di sospensione piuttosto mite qui presentato, la percentuale diminuisce a circa il 30% (HEK, cellule MLT). L&#39;occupazione singola cellula può essere migliorata mediante trattamento con tripsina delle cellule, ma puo anche alterare i risultati degli esperimenti. A seconda della molecola bersaglio, adsorbimento o assorbimento di PDMS possono influenzare i risultati. Adsorbimento può essere ridotta bloccando le superfici con BSA o PLL-g-PEG. L&#39;assorbimento è improbabile che la maggior parte delle biomolecole idrofile, ma dovrebbe essere controllato per (piccoli) componenti cellulari lipofile. <ol><li> Preparare le cellule secondo il protocollo specifico (ad esempio </em&gt; tossicodipendenza). Per cellule in sospensione, aggiungere celle direttamente al chip. Per linee cellulari adesive, utilizzare tampone dissociazione senza enzima per produrre una sospensione cellulare. Filtrare le cellule prima di introdurle al chip per ridurre la quantità di gruppi di cellule. </li><li> Caricare le cellule sul chip mediante una pompa a siringa e portata avanti, piuttosto che di ritirare la sospensione cellulare. Utilizzare un flusso di 5 ml / min per linee cellulari sospensione e portate maggiori di 10-20 ml / min per le cellule adesive da ridurre attaccamento aspecifica delle cellule sulle pareti del canale. </li><li> Quando le trappole sono pieni, chiudere le camere. Se molte cellule aderiscono non specifico alla superficie, cercare di lavarli via con tampone di dissociazione cellulare ad una portata di 10-30 ml / min. </li></ol> Protocollo A (saggi enzimatici) <ol start="4"><li> Prelevare tampone di lisi attraverso il chip. Per questo esempio, questo buffer è un buffer hypoosmolar con aggiunta di Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1% (v / v) di Tween 20). Per lisi, camere rapidamente aprire e chiudere (cioè 500 msec per portate di 10-50 ml / min 7,21). Per il saggio G6PDH, aggiungere 2 mM di glucosio-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml diaforasi e 0,3 mM resazurin al tampone di lisi. Avviare il monitoraggio della cinetica di reazione subito dopo la lisi. </li></ol> Nota: Scegliere una tampone che è adatto per il test, ma nudo in mente che detergenti aggressivi (come Triton, SDS), le cellule Lisare immediatamente e porterà ad una perdita di analita durante l&#39;apertura della camera. Protocollo B (i dosaggi) Per una breve descrizione degli esperimenti ELISA cellulari (le portate, stato da camera, ecc), si prega di fare riferimento alla Tabella 1. <ol start="5"><li> Per ELISA, aggiungere il reagente di rilevamento richiesto (es anticorpo secondario, antigene marcato) direttamente al tampone di lisi. Il presente documento ha aggiunto Tween 20 riduce l&#39;adsorbimento non specifico. Lisare le celle in base al punto 5.4. Incubare la miscela per 10-15 minuti per consentire la rilegatura (tempo di incubazione a seconda dell&#39;antigene utilizzato e anticorpo). </li><li> Coniugati anticorpo enzimatico che adsorbiti aspecifico alle pareti del canale possono portare ad una conversione del reagente di rilevamento già all&#39;interno del serbatoio e canali. Per ridurre i problemi di questa adsorbimento, lavare un inibitore permanente dell&#39;enzima rilevamento utilizzato attraverso il chip durante il tempo di incubazione (camere chiuse, prima di aggiungere il reagente di rilevamento). Per HRP, usare HCl 20 mM in acqua per inattivare gli enzimi aspecifico definitivamente assorbiti. </li><li> Dopo il tempo di incubazione, introdurre il reagente di rilevamento (es Amplex rosso e perossido di idrogeno per HRP) al chip. Aprire le camere di nuovo brevemente per lavare l&#39;anticorpo secondario nonbound distanza e aggiungere il reagente di rilevamento. Avviare il monitoraggio della reazione cinetica immediatamente. </li><li> Calibrazione: Immobilizzarel&#39;anticorpo contro il bersaglio di interesse. Chiudere camere. Preparare diverse concentrazioni di analita in tampone o in lisato cellulare off-chip. Applicare una concentrazione al chip e scambiare rapidamente il volume all&#39;interno delle camere (500 msec tempo di apertura). Questo tempo di apertura è sufficientemente breve per evitare un ulteriore accumulo si verifica da analita lavaggio, e solo un numero specifico di molecole dal volume della microcamera vengono rilevati. Dal noto concentrazione dell&#39;antigene all&#39;interno della soluzione e il volume della camera (625 pl), calcolare la quantità all&#39;interno della camera. Successivamente, continuare con il passo 5.5 e introdurre la parte di rivelazione. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La tecnologia microfluidica ha aperto nuove e affascinanti possibilità per l&#39;analisi singola cellula. In particolare, la possibilità di intrappolare e immobilizzare le cellule singolarmente dagli strumenti di microfluidica ha permesso studi sistematici a breve e lungo termine sulle proprietà monocellulari e la risposta. Inoltre, incapsulamento di cellule in microgocce alta frequenza, generati su un microchip, ha consentito studi di secrezione di cellule singole, che non possono essere eseguite con dispositivi cit...

Molti studi in passato hanno rivelato cellula-cellula differenze all&#39;interno di una vasta popolazione di cellule 1-3, in particolare segnalazione elabora 4 o la quantità di biomolecole come proteine ​​intracellulari 5,6, metaboliti e cofattori 7,8. Queste eterogeneità sono considerati di fondamentale importanza per l&#39;adattamento delle cellule e l&#39;evoluzione 9, ma anche svolgere un ruolo chiave nella nascita e nel trattamento di malattie come il cancro 10-13. Pertanto, studi sul livello di singola cellula sono di grande interesse nella ricerca biologica e farmacologica, soprattutto se questi studi rivelano le diverse risposte delle cellule dopo trattamento con sostanze chimiche bioattive. Negli ultimi anni, molte piattaforme analitiche sono state sviluppate che facilitano l&#39;analisi di cellule viventi singole o la composizione chimica del contenuto cellulare. Mentre fluorescente delle cellule attivate (FACS) è l&#39;oro stAndard per analisi molto alto-capacità di singole cellule viventi, il metodo non può essere impiegato per la quantificazione di composti intracellulari o secrete. L&#39;emergere di piattaforme microfluidica ha promesso nuove strategie analitiche per il posizionamento, il trattamento e l&#39;osservazione delle singole cellule. Una pietra miliare nella microfluidica è stato raggiunto con l&#39;integrazione di PDMS valvole flessibili realizzate da Quake e collaboratori 14,15. Queste valvole sono utili poiché possono isolare regioni sul chip, ad esempio separare due culture 16. Inoltre, sono particolarmente applicabile per l&#39;analisi di singole cellule e quindi contribuire a ridurre i problemi di diluizione degli analiti. La potenza di questo approccio per l&#39;analisi singola cellula è stato recentemente dimostrato da Hansen e colleghi, che hanno analizzato l&#39;espressione genica da centinaia di singole cellule in parallelo 17. Quando il targeting proteine ​​e metaboliti, l&#39;analisi è molto difficile a causa della mancanza di un adeguatometodi mplification, il gran numero di diversi composti presenti, e le loro variazioni di natura chimica. Inoltre, la maggior parte delle biomolecole intracellulari dovrebbero essere presenti in basso numero di copie nell&#39;ordine di qualche decina di migliaia 18, da cui il metodo analitico utilizzato deve avere una elevata sensibilità. Saggi più potenti come immunosaggi e immunoenzimatici (ELISA) sono difficili da integrare in dispositivi microfluidici quanto richiedono vari lavaggi e le fasi di incubazione e immobilizzazione superficie. A causa di questi problemi, non è sorprendente che solo alcuni esempi sono stati riportati in cui le proteine ​​o metaboliti sono stati quantificati a livello di singola cellula. Per esempio, studi sulla secrezione di composti fluorescenti sono stati segnalati 19,20. Recentemente, l&#39;implementazione con ELISA è stata presentata per l&#39;analisi di secrete (non fluorescente) proteine ​​da una coltura cellulare (cellule THP-1) 21 e singolo (immune) cellule 10. Targeting proteine ​​intracellulari, Shi et al. Sviluppato un dispositivo microfluidico che ha facilitato l&#39;identificazione di proteine ​​intracellulari per l&#39;analisi delle vie di segnalazione nelle cellule tumorali mediante un immunodosaggio 11. Tuttavia, solo quantità relative di proteine ​​sono stati determinati e nessuna amplificazione enzimatica è stato utilizzato per aumentare il segnale per le proteine ​​a bassa abbondanza. Recentemente, siamo stati in grado di combinare una cella singola cattura Microdevice con saggi di fluorescenza 8 e immunoassays 22 (Figura 1). Le cellule sono passivamente intrappolati in strutture ostacolo microsized, che permettono di alimentazione e (rapido) scambio di medie e di altri agenti chimici senza alcun movimento delle cellule. Una valvola ad anello attorno a ciascuna trappola consente l&#39;isolamento della cella in un volume molto piccolo (&quot;microcamera&quot;). Questa valvola viene attivata subito dopo aver introdotto una cella-lisi (hypoosmolar) tampone, eglince prevenire molecole intracellulari o molecole secrete a diffondere via. Ancora più importante, a causa delle ridotte dimensioni del volume (625 pl) è evitata grande diluizione delle molecole. Inoltre, poiché lisi e analisi vengono eseguite nella stessa posizione nel chip, non vi è alcuna perdita di analiti dovuti al trasporto. La progettazione di chip qui descritto comprende 8 righe alterne di 7 o 8 microchambers, per un totale di 60 microchambers. Le camere sono azionati in file, in modo che la contaminazione incrociata lungo una linea è preclusa. La piattaforma può essere utilizzata in combinazione con saggi di fluorescenza e test immunologici (Figura 1D). Per questi ultimi, abbiamo stabilito protocolli per l&#39;immobilizzazione degli anticorpi, che sono compatibili con la produzione di chip e processo di assemblaggio. Quindi la piattaforma apre la strada a test sensibile, affidabili e quantificabili a livello di singola cellula. Fino ad ora, abbiamo utilizzato il dispositivo per l&#39;analisi di ienzimi ntracellular e secrete (quantificazione relativa da saggi enzimatici), cofattori intracellulari, proteine ​​e piccole molecole (quantificazione assoluta mediante saggi endpoint o ELISA). Nel seguito si descrive il processo di fabbricazione di chip mediante multistrato litografia morbida e protocolli per patterning degli anticorpi tramite stampa microcontact e chimica di superficie. Inoltre, alcuni esempi di utilizzo del chip e le operazioni sono dati.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name of the Reagent</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td><td>ABCR (Karlsruhe, Germany)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &amp;beta;-D-N,N&amp;prime;-diacetylchitobioside hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>AZ 726 developer</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin, biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazane (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG grafted biotin</td><td>SuSoS, (D&amp;uuml;bendorf, Switzerland)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Protein G, biotin</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Si-Mat (Kaufering, Germany)</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td><td>Biorad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Name</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comments (optional)</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES syringe filter</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1.5 mm biopsy puncher</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics filter 20 &amp;micro;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>MA-6 mask aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Multizoom AZ100M microscope</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Spin Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Switzerland</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Step profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

Presentiamo un dispositivo microfluidico che consente la determinazione quantitativa di biomolecole intracellulari in più celle singole in parallelo. A questo scopo, le cellule sono passivamente intrappolati nel mezzo di una microcamera. All&#39;attivazione del livello di controllo, la cella è isolato dal volume circostante in una piccola camera. Il volume circostante può quindi essere scambiati senza compromettere la cellula isolata. Tuttavia, dopo breve apertura e la chiusura della camera, la soluzione nella camera può essere sostituito entro poche centinaia di millisecondi. A causa della reversibilità delle camere, le cellule possono essere esposti a soluzioni diverse sequenzialmente in un modo altamente controllabile, ad esempio per incubazione, lavaggio, infine, lisi cellulare. I microchambers ermeticamente chiusi consentono il mantenimento del lisato, minimizzare e controllare la diluizione dopo lisi cellulare. Poiché lisi e analisi avvengono nello stesso luogo, l&#39;alta sensibilità viene mantenuta perché senza ulteriori dilution o la perdita degli analiti avviene durante il trasporto. Il design microcamera consente pertanto l&#39;analisi affidabile e riproducibile di piccolissimi numeri di copie di molecole intracellulari (attomoli, zeptomoles) rilasciate dalle cellule singole. Inoltre, molti microchambers possono essere organizzati in un formato matrice, consentendo l&#39;analisi di molte celle contemporaneamente, dato che gli strumenti ottici adatti vengono utilizzati per il monitoraggio. Abbiamo già utilizzato la piattaforma per proof-of-concept studi per analizzare le proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori e secondi messaggeri in maniera quantificabile sia relativo o assoluto.

La nostra piattaforma è in grado di analizzare una varietà di intracellulare nonché molecole secrete o produce da singole cellule. Ecco, vorremmo presentare diversi studi di esempio per sottolineare la varietà di possibili saggi. Daremo un esempio di un enzima secreto (Figura 5a), così come un enzima intracellulare (Figura 5b) e proteine ​​(figure 5c e d). Per altri esempi, come cofattori o piccole molecole, consultare Eyer et al. (201...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l&#39;analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici.

Un chip microfluidica per la Versatile analisi chimica di singole cellule

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  ETH Zurich, Switzerland.  In questo articolo vi presentiamo un chip microfluidica per l'analisi singola cellula. Esso consente la quantificazione delle proteine ​​intracellulari, enzimi, cofattori, e secondi messaggeri per mezzo di saggi fluorescenti o immunologici. 

Video: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Bioingegneria

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics per sintesi chimica e risolte nel tempo meccanicistici Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Un Biochip elettrochimica Microfluidic-based per la libera-Label Ibridazione DNA Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Progettazione di dispositivi microfluidici per lo studio Risposte cellulare in singolo o Coesistenza chimico / elettrico / Shear stress stimoli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generazione di condizioni ambientali dinamiche utilizzando un dispositivo microfluidico ad alta produttività

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...