Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (R01-HL095828 di Kay MW).

1. Impostazione per lo Studio <ol><li> Preparare quattro litri di modifica Krebs-Henseleit soluzione di 16 (in mM: 118 NaCl, 3,30 KCl, CaCl 2 2,00, 1,20 MgSO 4, 24,0 NaHCO 3, 1,20 KH 2 PO 4, glucosio 10,0, 2,00 NaPyruvate, e 20,0 mg / L albumina ). La soluzione deve essere preparata come prossimità dell&#39;inizio dell&#39;esperimento possibile. Il pH deve essere regolato a 7,4 dopo la filtrazione sterile (dimensione dei pori: 22 micron, Corning). Osmolalità soluzione deve essere tra 275 e 295 mOsm / kg. </li><li> Sciacquare tutti i tubi e le camere di cuore del sistema di lavoro con acqua purificata. Eseguire pompe finché tutta l&#39;acqua è stata rimossa dal sistema. </li><li> Aggiungi filtri a membrana di cellulosa (dimensione dei pori: 5 micron, ADVANTEC) in linea con ciascuna delle pompe di perfusione (pompa di perfusione Langendorff, a sinistra della pompa perfusione cardiaca, e proprio la pompa perfusione cardiaca). </li><li> Eseguire una calibrazione a due punti (0 e 60 mmHg) per ogni sensore di pressione. </li><li>Accendere i bagni. Un bagno riscaldato acqua circolante (Cole Palmer) viene utilizzato per riscaldare l&#39;acqua con camicia tubi e scambiatori di calore. Perfusato viene pre-riscaldato in un bagno di acqua separata (Oakton Instruments). Entrambi i bagni sono impostati per mantenere una temperatura soluzione di 37 ° C. </li><li> Accendere le pompe per far circolare il perfusato in un anello chiuso. Perfusato passa attraverso ossigenatori in microfibra (hemofilters) gasati con il 95% O 2 e 5% CO 2 a 80 kPa. Perfusato ossigenata scorre poi attraverso scambiatori di calore per mantenere ad una temperatura di 37 ° C prima di entrare nella cannule cuore. </li></ol> 2. Cuore Escissione <ol><li> Iniziare impostando il sistema di cuore al lavoro per operare in modo costante Langendorff pressione. Impostare la pressione del blocco aortica entro l&#39;intervallo da 50 a 60 mmHg. </li><li> Anestetizzare la coniglio con una iniezione intramuscolare di ketamina (44 mg / Kg) e xilazina (10 mg / Kg). Dopo il coniglio è sedato, pentobarbital (50 mg / Kg) ed eparina (2000 U) viene iniettata per via endovenosa attraverso la vena marginale dell&#39;orecchio o la vena safena laterale all&#39;interno dell&#39;arto posteriore. </li><li> Quando il coniglio è completamente non-reattivo, come determinato da una mancanza di dolore riflesso, la cavità toracica viene aperto rapidamente, il pericardio è tagliato, l&#39;aorta viene bloccato, e il cuore e polmoni sono rimossi. A questo punto i polmoni dovrebbe essere lasciata attaccata al cuore per aiutare a isolare le vene polmonari. </li><li> Isolare e incannulare l&#39;aorta con una cannula diametro di 5 mm che è attaccato ad una siringa riempita con 60 ml perfusato e 200 unità di eparina. Fissare l&#39;aorta alla cannula con sutura di seta zero dimensioni e lentamente premere il siringa per lavare il cuore di sangue. </li></ol> 3. Cannulazione biventricolare <ol><li> Collegare il cuore al blocco aortica del sistema cardiaco di lavoro. Impedire all&#39;aria di entrare nella aorta, che può causare emboli coronarica. Si consiglia di allegare la cannula al bl aorticaOCK avvicinando il connettore aortica ad un angolo obliquo e consentendo perfusato a gocciolare dolcemente dal connettore nella cannula mentre è installata. </li><li> Mentre il cuore è perfuso in modo costante Langendorff pressione, togliere il grasso e tessuto connettivo e individuare i vasi seguenti: inferiore e vena cava superiore, vena azygos, arteria polmonare, vene polmonari. </li><li> Legare la vena cava superiore. Tagliare l&#39;arteria polmonare appena al di sotto dove si dirama verso le arterie polmonari destra e sinistra. </li><li> Raggruppare tutti i vasi rimanenti (delle vene polmonari) tra il cuore ei polmoni e legare il tutto con una sutura. Rimuovere i polmoni. </li><li> Praticare un piccolo foro in un angolo dell&#39;appendice atriale sinistra. Assicurarsi che il LA è pieno di perfusato. Incannulare la LA assicurando nel contempo che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserito. Suturare la cannula per l&#39;appendice LA. </li><li> Accendere la pompa del lato sinistro (pompa # 2) per fornire un flusso di tha lasciato atrio. Impostare la pressione precarico tra 2-6 mmHg e regolare ± 2 mmHg, come determinato dalla dilatazione atriale. </li><li> Accendere il cuore a cuore la modalità di lavoro disattivando la pompa Langendorff (pompa # 1). </li><li> Momentaneamente diminuire la pressione aortica a 10 mmHg e poi lentamente per aumentare nell&#39;intervallo da 80 a 100 mmHg. Questo permetterà la valvola aortica per aprire e funzionare come sarebbe in condizioni fisiologiche normali. La pressione finale postcarico dipenderà la contrattilità del LV. Esso dovrebbe essere impostato ad un valore che è circa 20 mmHg inferiore alla pressione di picco LV. </li><li> LV portata cardiaca può essere determinata misurando la portata del perfusato all&#39;uscita dal blocco aortica (ml / min). Gittata cardiaca normale è tra 14,77 e 16,43 mL / min per 100 g di peso corporeo 17 e medie 340 mL / min per un coniglio 2,2 kg. Pressione aortica dovrebbe assomigliare il segnale di pressione illustrato in Figura 1. </li><li> Cannulare il RA attraverso l&#39;inferior vena cava. Verificare che il RA e la cannula vengano riempiti con perfusato e inserire la cannula evitando la formazione di bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per la vena. </li><li> Accendere la pompa del lato destro (pompa # 3) per fornire un flusso all&#39;atrio destro. Impostare la pressione di circa 3 mmHg. </li><li> Assicurarsi che il RV è pieno di perfusato e incannulare l&#39;arteria polmonare. Assicurarsi che la cannula è completamente riempito con perfusato mentre viene inserita per evitare bolle d&#39;aria. Suturare la cannula per l&#39;arteria polmonare. </li></ol> 4. Acquisizione del segnale: Pressioni, potenziali d&#39;azione monofasici e fNADH <ol><li> Una volta cannulazione biventricolare è completa, cura di inserire il catetere trasduttore di pressione (Millar) nell&#39;aorta attraverso la cannula aorta. Delicatamente navigare oltre la valvola aortica e nella LV. Monitorare il segnale di pressione LV per garantire il corretto posizionamento della punta del catetere. Un esempio di pressione LV è mostratoin figura 1. </li><li> Premere delicatamente il potenziale d&#39;azione monofasico elettrodo contro epicardio ventricolare. Monitorare il segnale per ottenere adeguate misure di potenziale d&#39;azione. Artefatto lieve movimento del segnale è normale. </li><li> Posizionare un elettrodo bipolare stimolo sulla atrio destro a passeggiare per il cuore. Nel nostro protocollo, cuori erano in ritmo la durata del ciclo tra i 300 e 150 msec, corrispondenti a 200 e 400 bpm, rispettivamente. </li><li> Misurare la temperatura della superficie epicardica LV. Se lo studio richiede che la temperatura è mantenuta a 37 ° C poi posizionare il cuore all&#39;interno di una camicia d&#39;acqua della camera cardiaca o immergere il cuore in un bagno superfusate riscaldata per mantenere una temperatura costante in tutto il cuore. </li><li> Posizionare la fotocamera CCD (Andor ixon DV860, 128x128 pixel) e la messa a fuoco in modo tale che un campo appropriato di vista si osserva. La fotocamera è collegata a una workstation e le immagini vengono acquisite a 2 fps utilizzando Andor SOLIS softwari. </li><li> Accendere la luce lampada a mercurio prima dell&#39;inizio di imaging. La luce è diretta attraverso un filtro di eccitazione (350 ± 25 nm, la tecnologia Chroma) e in un breve fibre ottiche (Horiba Jobin Yvon modello 1950-1M) per illuminare la superficie del cuore. L&#39;attenuazione della luce UV attraverso la guida di luce è piccola. Illuminazione UV potrebbero essere forniti anche con un sistema ad alta potenza LED costituito da faretti LED (Mightex PLS-0365-030-S) e un&#39;unità di controllo (Mightex SLC-SA04-US). </li><li> Spegnere la luce della stanza e ridurre al minimo l&#39;illuminazione ambiente. Puntare le boccole della guida di luce (o faretti LED) al centro per rendere uniforme l&#39;illuminazione epicardico. Emissione NADH fluorescenza (fNADH) passa attraverso un filtro per le emissioni (460 ± 20 nm tecnologia Chroma) e viene ripreso dalla telecamera CCD. </li><li> FNADH monitorare i cambiamenti nel tempo, selezionando una regione di interesse utilizzando il software di imaging. Selezionare live-modalità di aggiornamento per monitorare l&#39;intensità media dei pixel all&#39;interno della regione of interesse. </li><li> Il cuore dovrebbe funzionare in modalità biventricolare lavorando per generare pressioni adeguate. livelli fNADH deve essere bassa e stabile sulla superficie epicardica per confermare adeguata perfusione coronarica. A questo punto in studio uno specifico protocollo sperimentale dovrebbe essere attuata per verificare una ipotesi. </li><li> Quando lo studio è completato, togliere il cuore dal sistema e far defluire tutto perfusato. Sciacquare il tubo del sistema e le camere con acqua purificata. Per la manutenzione ordinaria, il sistema deve essere periodicamente risciacquato con una soluzione diluita Mucasol o una soluzione di acqua ossigenata, come necessario. </li></ol> 5. Off-line Elaborazione delle immagini fNADH <ol><li> Un modo per confrontare dataset NADH (fNADH (i, j, t)) tra esperimenti è normalizzare ogni immagine di fluorescenza usando un&#39;immagine di riferimento (fNADH (i, j, t 0)) dal set di dati 9, come mostrato nella seguente equazione . Un altro modo per normalizzare NADH fluorescenza è plasso un piccolo pezzo di vetro uranile nel campo visivo prima dell&#39;esperimento 9, 18, ​​19. Vetro uranile volontà fluorescenza (450 - 550 nm) quando illuminate con luce UV per fornire un segnale che può essere usato come un riferimento stabile. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115eq1.jpg" /> 6. Risultati rappresentativi Viste anteriore e basale di una preparazione biventricolare coniglio lavoro cardiaco sono illustrati nella Figura 1. Pressione ventricolare sinistra è stata misurata mediante la navigazione di un catetere trasduttore di pressione (Millar SPR-407) oltre la valvola aortica e nel ventricolo sinistro. Pressioni ventricolari aortica, l&#39;arteria polmonare, ea sinistra (LVP) sono mostrati in figura 1C. Diastolica LVP è solitamente tra 0 e 10 mmHg. La pressione minima aortica diastolica è di circa 60 mmHg. Picco sistolico LVP dipende dalla pressione di riempimento (il precarico o la pressione LA) e della contrattilitàe, in modo ottimale, dovrebbe essere tra 80 e 100 mmHg. La pressione aortica massima e LVP dovrebbe strettamente corrispondere, come mostrato nella figura 1C. Potenziali d&#39;azione monofasici (MAP) con una fase di depolarizzazione veloce e una fase di ripolarizzazione, che sono tipici cuore di coniglio sono mostrati nella figura 1D. MAP può essere registrato con relativa facilità da un cuore appaltante ma avrà solitamente artefatto piccolo movimento durante la diastole, come mostrato nella figura 1D. MAP sono utili per verificare il successo trascinamento del cuore (cattura) durante la stimolazione e può anche essere usato per misurare variazioni locali elettrofisiologiche dovute a ischemia o altre perturbazioni acute. Un ECG può anche essere misurata immergendo il cuore in un bagno di superfusate caldo e ponendo un elettrodo in bagno sui lati sinistro e destro del cuore. Un terzo elettrodo indifferente o è posto nel bagno, lontano dal cuore, o è collegato al aorta.Un ECG fornirà informazioni riguardanti il ​​processo di eccitazione globale e ripolarizzazione, che è utile per la valutazione globale funzioni elettriche e per rivelare la presenza di ischemia. fNADH immagini rivela cambiamenti nello stato redox mitocondriale del cuore, che possono essere utilizzati per misurare la progressione spazio-temporale di regioni ischemiche o ipossia. Per questo studio, epicardico fNADH è stata misurata per monitorare i cambiamenti nello stato redox nel corso di tre frequenze di stimolazione alla durata del ciclo (CLS) di 300, 200 e 150 msec. Valori medi fNADH provenienti da una regione di interesse (scatola rossa, figura 2) mostrano che i livelli basali fNADH aumentare la durata del ciclo si accorcia. Quando frequenza di stimolazione è vicino a ritmo sinusale (CL = 300 msec) fNADH livello basale è relativamente costante. Poiché la durata del ciclo si accorcia inferiore a 300 msec, di base fNADH aumentare i livelli, con il maggiore incremento alla minima CL (150 msec). FNADH immagini ad alta risoluzione di tutta la superficie anteriorea 200 e 400 bpm è mostrato in Figura 3. livelli fNADH a 200 bpm erano costanti e spazialmente omogenei. A 400 bpm, i livelli di fNADH aumentato notevolmente in tutta l&#39;epicardio. Significativa eterogeneità spaziale è stata osservata con gli incrementi maggiori si verificano nelle regioni del setto della RV e LV. Il segnale fNADH oscilla con contrazione (artefatti movimento) e la frequenza di oscillazione corrisponde alla frequenza cardiaca (Figura 2). In incannulamento biventricolare, la base del cuore è tenuto da 4 cannule, che aiuta a prevenire il cuore di oscillazione durante la contrazione. Pertanto, ampiezza di oscillazione è sempre inferiore rispetto a qualsiasi arco temporale più lungo (5-10 sec) tendenze fNADH che sono causate da ischemia o ipossia. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig1.jpg" /> Figura 1. Pressioni tipiche e potenzialità di azione monofasici da un isolato di lavoro biventricolare rabbit cuore. A. vista basale del cuore che mostra i quattro cannule: 1, aortica, 2, arteria polmonare, 3, atriale sinistra, e 4, atriale destra vista anteriore, B. del cuore che mostra il ventricolo sinistro (LV) e il ventricolo destro. (RV). C. rappresentativi pressioni. Top: pressione ventricolare sinistra (linea continua) e la pressione aortica (linea tratteggiata). In basso: la pressione polmonare. D. potenziali d&#39;azione monofasici rappresentativi. Il segnale è allineato con le pressioni indicate nel pannello di C. <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4115/4115fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig2.jpg" /> Figura 2. fNADH immagini di un biventricolare lavoro cuore di coniglio isolato. Top: Una vignetta del campo di vista (a sinistra) e tre immagini fNADH vengono visualizzati. Il corrispondente lunghezza del ciclo di stimolazione (CL) è indicata su ogni immagine.La regione di interesse per il segnale fNADH nel pannello inferiore è indicato dal riquadro rosso. La punta dell&#39;elettrodo monofasica potenziale di azione si vede a destra della regione di interesse. Il epicardio era illuminata con la lampada a mercurio e guida di luce, come mostrato nella Figura 5. Solo la superficie epicardica circonda la regione di interesse è stata illuminata basso:. FNADH medio per la regione di interesse indicato dal riquadro rosso nel pannello superiore. Aumenti medi fNADH con la lunghezza di ciclo ridotti. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4115/4115fig3.jpg" /> Figura 3. fNADH immagini di tutta la superficie anteriore di un isolato di lavoro biventricolare cuore di coniglio. Il cuore è stato stimolato dalla RA a 200 bpm e 400 bpm. fNADH è stato ripreso (2 fps, 128x128 pixel con una risoluzione di 0,4 mm), mentre illumina l&#39;intera epicardio anteriore con due LED ad alta potenza (Mightex PLS-0365-030-S, 365 nm, 4% intensity, 50 mW max).

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+performance+as+a+function+of+intracellular+oxygen+tension+in+buffer-perfused+hearts.">Cardiac performance as a function of intracellular oxygen tension in buffer-perfused hearts.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2463-H2472 (2001).</li><li>Pijl, A. J., Pfaffendorf, M., Mathy, M., Van Zwieten, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+by+nifedipine+in+isolated+working+hearts:+A+comparative+study+on+three+different+types+of+experimental+ischemia.">Cardioprotection by nifedipine in isolated working hearts: A comparative study on three different types of experimental ischemia.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 70-76 (1993).</li><li>Khatib, S. Y., Boyett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glyburide+(glibenclamide)+on+myocardial+function+in+langendorff+perfused+rabbit+heart+and+on+myocardial+contractility+and+slow+calcium+current+in+guinea-pig+single+myocytes.">Effects of glyburide (glibenclamide) on myocardial function in langendorff perfused rabbit heart and on myocardial contractility and slow calcium current in guinea-pig single myocytes.</a> Mol. Cell Biochem. 242, 81-87 (2003).</li><li>Kates, R. E., Yee, Y. G., Hill, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+albumin+on+the+electrophysiologic+stability+of+isolated+perfused+rabbit+hearts.">Effect of albumin on the electrophysiologic stability of isolated perfused rabbit hearts.</a> J. Cardiovasc. Pharmacol. 13, 168-172 (1989).</li><li>Combs, C. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+imaging+of+dehydrogenase+activity+within+living+cells+using+enzyme-dependent+fluorescence+recovery+after+photobleaching+(ED-FRAP).">Direct imaging of dehydrogenase activity within living cells using enzyme-dependent fluorescence recovery after photobleaching (ED-FRAP).</a> Biophys. J. 80, 2018-2028 (2001).</li><li>Coremans, J. M., Ince, C., Bruining, H. A., Puppels, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Semi-)quantitative+analysis+of+reduced+nicotinamide+adenine+dinucleotide+fluorescence+images+of+blood-perfused+rat+heart.">(Semi-)quantitative analysis of reduced nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence images of blood-perfused rat heart.</a> Biophys J. 72, 1849-1860 (1997).</li><li>Scholz, T. D., Laughlin, M. R., Balaban, R. S., Kupriyanov, V. V., Heineman, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+substrate+on+mitochondrial+NADH,+cytosolic+redox+state,+and+phosphorylated+compounds+in+isolated+hearts.">Effect of substrate on mitochondrial NADH, cytosolic redox state, and phosphorylated compounds in isolated hearts.</a> Am. J. Physiol. 268, 82-91 (1995).</li><li>Holcomb, M. R., Woods, M. C., Uzelac, I., Wikswo, J. P., Gilligan, J. M., Sidorov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+dual+camera+systems+for+multimodal+imaging+of+cardiac+electrophysiology+and+metabolism.">The potential of dual camera systems for multimodal imaging of cardiac electrophysiology and metabolism.</a> Exp. Biol. Med. (Maywood). 234, 1355-1373 (2009).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il cuore isolato Langendorff perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. È particolarmente utili negli studi di aritmie cardiache, in particolare quelle che utilizzano immagini di fluorescenza potenziale transmembrana 20. Un vantaggio è che l&#39;intero epicardio del cuore isolato può essere osservato 21, 22. Un altro vantaggio è che, in contrasto con sangue, perfusione con una soluzione limpida tampone cristalloide non interferisce con i segnali di fluorescenza. Una limitazione è che la tecnica Langendorff non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che spesso richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Per elevare la rilevanza dei preparativi cuore isolato per studi metabolici, Neely ha introdotto modifiche alla tecnica Langendorff per stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3.Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Il cuore del modello LV di lavoro è superiore al modello Langendorff per le valutazioni funzionali, ma non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare (LV e RV) come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8. A RV caricata correttamente inoltre migliora la funzione del setto diminuendo gradienti di pressione anomale attraverso il setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, pressione media polmonare, la frequenza cardiaca e infarto del miocardio ATP, ei livelli di creatina fosfato per un massimo di 3 ore 8. Biventricolare studi cardiaci di lavoro in genere utilizzano i cuori from piccoli animali quali ratti e conigli, perché la gittata cardiaca e il volume richiesto di perfusato sono molto inferiore a quella dei cuori degli animali più grandi. Tuttavia, biventricolare studi cardiaci di lavoro sono stati eseguiti utilizzando i cuori di suini, canini, e anche esseri umani 23, 24. Il fabbisogno metabolico dei cuori isolati in modo lavorazione biventricolare è notevolmente superiore a quello di perfusione Langendorff. E &#39;importante che la soluzione perfusato fornire abbastanza ossigeno e substrati metabolici per supportare la funzione cardiaca biventricolare. Soluzioni tampone standard cristalloidi, come Krebs-Henseleit 16, 17, 25 o Tyrodes 26, 27, hanno solubilità ossigeno alto come 5,6 mg / L. Quando queste soluzioni sono gasati con CarboGen (una miscela di gas del 95% O 2 e il 5% CO 2) e contiene gli opportuni substrato metabolico (glucosio, destrosio e / o di piruvato di sodio), che siano adatti biventricolare cuori di lavoro batte a normaAl tasso del seno (circa 180 bpm per un coniglio). Aumenta la richiesta metabolica di ritmi veloci e la quantità di ossigeno disciolto in perfusates standard potrebbe non essere sufficiente per supportare pienamente un cuore biventricolare di lavoro che si sta contraendo a tassi elevati. Soluzioni tampone cristalloidi contenenti eritrociti o miste con sangue intero sono stati usati in preparati cardiaci di lavoro per assicurare un&#39;adeguata disponibilità di ossigeno. Studi precedenti hanno dimostrato che l&#39;aggiunta di eritrociti a una soluzione di Krebs-Henseleit un miglioramento della funzione cardiaca di lavoro durante rigorosi protocolli di stimolazione e anche ridotto l&#39;incidenza di fibrillazione ventricolare 16. Una limitazione di utilizzare eritrociti o miscele di sangue intero è che l&#39;emoglobina interferisce con lunghezze d&#39;onda che vengono utilizzati per l&#39;imaging fluorescenza 13. Altri substrati, come albumina, possono anche essere aggiunti perfusato soluzioni per prolungare vitalità cuore e ridurre l&#39;edema 28. Durante l&#39;imaging di fluorescenza l&#39;intensità della luce di eccitazione deve essere elevata e la distribuzione della luce dovrebbe essere uniforme. Realizzare un&#39;illuminazione uniforme non è sempre facile a causa della curvatura della superficie epicardica. Nei nostri studi abbiamo fNADH immagine filtrando la luce (350 ± 25 nm) da una lampada al mercurio. Una biforcato guida ottica viene usato per dirigere la luce UV sulla superficie epicardica. Illuminazione uniforme può essere ottenuto il corretto posizionamento delle due ghiere di uscita. UV sorgenti LED potrebbero anche essere utilizzati, come abbiamo dimostrato nella Figura 3. Sorgenti LED sono relativamente poco costoso in modo più fonti potrebbero essere inserite in un sistema di imaging. I LED possono anche essere attivata e disattivata a tassi elevati di sincronizzare la luce di eccitazione, con acquisizione delle immagini. Photobleaching di NADH deve essere minimizzata 29 riducendo il tempo di illuminazione tessuto. Ciò può essere fatto bicicletta l&#39;illuminazione e spegnimento con un elettroneic otturatore e una lampada o con un sistema di illuminazione a LED ed un controllore. Se l&#39;illuminazione è sincronizzato con il ciclo cardiaco, quindi l&#39;acquisizione di immagini fNADH potrebbe essere limitato diastole, che ridurrebbe manufatto movimento nei segnali di fluorescenza. Trigging illuminazione e l&#39;acquisizione di immagini utilizzando un segnale di pressione, come la pressione LV, sarebbe un modo per fare questo. Nei nostri studi abbiamo osservato che le variazioni fNADH per unità di tempo può essere più di 5 volte superiore a 400 bpm rispetto a 200 bpm. Questo indica che ritmi veloci elevare lo stato redox del cuore. Sia o no questo è causato da ipossia o l&#39;incapacità dei miociti per ossidare NADH a NAD + con sufficiente rapidità per evitare l&#39;accumulo di NADH è ancora una domanda senza risposta. Le prestazioni di un preparato biventricolare cuore di lavoro è condizionato da molti fattori. Uno dei più importanti è quello di impostare adeguate pressioni di precarico e postcarico per imitare il fisiologicocondizioni che sono sotto inchiesta. In particolare, il postcarico LV (pressione aortica) deve essere regolato per rappresentare la pressione sistemica. Se è troppo elevato, il LV non sarà in grado di superare la pressione, con conseguente rigurgito. Pressione troppo bassa avrà effetti negativi sulla perfusione coronarica. La pressione di precarico LV (la pressione atriale sinistra) dovrebbe anche essere regolato per fornire un volume telediastolica che è appropriato per il protocollo sperimentale. fNADH imaging di tessuto vivente è una modalità consolidata di imaging di fluorescenza 13. La sua applicazione al tessuto cardiaco è stato illustrato da Barlow e Chance, quando hanno segnalato aumenti notevoli di fNADH all&#39;interno del tessuto regionale, dopo la legatura ischemico e 14 di un vaso coronarico. Le loro immagini fNADH sono state registrate su pellicola utilizzando una macchina fotografica oscilloscopio Fairchild e flash UV. Coremans et al. estesa, questo concetto utilizzando la fluorescenza / UV quoziente di riflettenze NADH a misurazionee lo stato metabolico del epicardio di Langendorff sangue perfusi cuori di ratto 30. A videofluorimeter è stato utilizzato per l&#39;imaging e dati è stato registrato utilizzando un registratore video. Più tardi, Scholz et al. utilizzato un array di fotodiodi spettrografo e misurare fNADH media da una vasta area del LV. Questo approccio riduce gli effetti di fluorescenza epicardici eterogeneità e le variazioni locali in circolazione mentre rivelare macroscopici legati al lavoro variazioni di fNADH 31. Questo approccio è simile a livelli medi fNADH calcolo per una regione di interesse in tutti i fotogrammi di un set di dati fNADH immagini, come illustrato in figura 2. Come abbiamo presentato in questo articolo, la tecnologia di oggi offre ad alta velocità telecamere CCD e controllo digitale ad alta potenza faretti UV. Queste tecnologie consentono le dinamiche spazio-temporali di fNADH cardiaca e il metabolismo di essere studiato da molte nuove prospettive. Il relativamente basso costo delle ottiche e delle sorgenti luminose rende fNADH immagine di un accessorio utile per sistemi convenzionali cardiaci mappatura ottici. 9, 32

<table border="1"><tbody><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> S-3014 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P3911-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C77-500 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M-7506 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S-233 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> 423-316 </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 158968-500G </td></tr><tr><td> NaPyruvate </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> P2256-25G </td></tr><tr><td> Albumina </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> A9418-100G </td></tr></tbody></table>

nadh fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts

Fin dalla sua nascita da Langendorff 1, il cuore isolato perfuso rimane uno strumento importante per studiare la fisiologia cardiaca 2. Tuttavia, non è adatto per studi di metabolismo cardiaco, che richiedono il cuore per eseguire lavori nel contesto di precarico fisiologica e pressioni citotossici. Neely modifiche introdotte alla tecnica Langendorff a stabilire appropriate del ventricolo sinistro (LV) precarico e le pressioni citotossici 3. Il modello è noto come isolato cuore modello LV lavoro ed è stato ampiamente utilizzato per studiare le prestazioni LV e metabolismo 4-6. Questo modello, tuttavia, non fornisce un ventricolo caricata correttamente destro (RV). Demmy et al. prima riportato un modello biventricolare come una modifica del modello LV cuore di lavoro 7, 8. Essi hanno scoperto che lo sviluppo della gittata sistolica, la gittata cardiaca e la pressione migliorato nei cuori convertiti dalla modalità di lavoro LV a biventricolare modalità di lavoro 8 </sup&gt;. A RV caricata correttamente diminuisce anche gradienti di pressione anomali attraverso il setto per migliorare la funzione del setto. Biventricolare cuori di lavoro hanno dimostrato di mantenere la produzione aortico, flusso polmonare, la pressione aortica, frequenza cardiaca e del miocardio livelli di ATP per un massimo di 3 ore 8. Studiando gli effetti metabolici di lesione del miocardio, quali ischemia, è spesso necessario per identificare la posizione del tessuto colpito. Ciò può essere fatto di imaging la fluorescenza del NADH (forma ridotta di nicotinammide adenina dinucleotide) 9-11, un coenzima trova in grandi quantità nei mitocondri. NADH fluorescenza (fNADH) che presenta un rapporto vicino lineare inversa con 12 locali concentrazione di ossigeno e fornisce una misura dello stato redox mitocondriale di 13. Imaging fNADH durante condizioni di ipossia e ischemica è stato usato come colorante libero metodo per identificare regioni ipossiche 14, 15 e per monitorare la progressione dicondizioni di ipossia nel tempo 10. L&#39;obiettivo del metodo è di monitorare lo stato redox mitocondriale di biventricolare cuori di lavoro durante protocolli che alterano il metabolismo miociti o indurre ipossia o creare una combinazione dei due. Cuori da conigli bianchi New Zealand stati collegati ad un sistema biventricolare cuore di lavoro (Hugo Sachs Elektronik) e perfusi con modificato Krebs-Henseleit soluzione 16 a 37 ° C. Aortica, LV, arteria polmonare, e la pressione atriale destra e sinistra sono stati registrati. L&#39;attività elettrica è stata misurata usando un elettrodo monofasica potenziale d&#39;azione. Per immagine fNADH, la luce da una lampada a mercurio è stato filtrato (350 ± 25 nm) e utilizzato per illuminare il epicardio. Luce emessa è stata filtrata (460 ± 20 nm) e ripreso con una telecamera CCD. Cambiamenti nella fNADH epicardica biventricolare cuori di lavoro durante frequenze di stimolazione differenti sono presentati. La combinazione del modello cuore e fNADH immaginifornisce un nuovo strumento prezioso e sperimentale per lo studio delle patologie cardiache acute nel contesto di realistici condizioni fisiologiche.

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

L&#39;obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

nadh-fluorescence-imaging-isolated-biventricular-working-rabbit

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K Views.  The George Washington University. L'obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametrica mappatura ottica del Langendorff-perfuso Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Ricerca

Bioingegneria

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Biologia

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Medicina

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

L'iniezione intramiocardica ecocardiografia-guida percutanea contrasto e consegna delle cellule in un modello preclinico grande

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Transthoracic Echocardiographic Examination in the Rabbit Model

Large animal models such as the rabbit are valuable for translational preclinical research. Rabbits have a similar cardiac electrophysiology compared to that of humans and that of other large animal models such as dogs and pigs. However, the rabbit model has the additional advantage of lower maintenance costs compared to other large animal models. The longitudinal evaluation of cardiac function using echocardiography, when appropriately implemented, is a useful methodology for preclinical assessment of novel therapies for heart failure with reduced ejection fraction (e.g. cardiac regeneration). The correct use of this non-invasive tool requires the implementation of a standardized examination protocol following international guidelines. Here we describe, step by step, a detailed protocol supervised by veterinary cardiologists for performing echocardiography in the rabbit model, and demonstrate how to correctly obtain the different echocardiographic views and imaging planes, as well as the different imaging modes available in a clinical echocardiography system routinely used in human and veterinary patients.

Here we describe, step by step, a detailed protocol for performing echocardiography in the rabbit model. We show how to correctly obtain the different echocardiographic views and imaging planes, as well as the different imaging modes available in a clinical echocardiography system routinely used in human and veterinary patients.

Esame ecocardiografico transtoracico nel modello del coniglio

Large animal models such as the rabbit are valuable for translational preclinical research. Rabbits have a similar cardiac electrophysiology compared to ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roditore Working Model Cuore per lo Studio della performance miocardica e consumo di ossigeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

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