Riconosciamo sostegno da parte Scienze Chimiche, Geoscienze e Biosciences Division, Office of Basic Sciences Energy, Office of Science, US Department of Energy (numero Premio DE-FG02-91ER20021) e National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Siamo grati a Bird sig.ra Karen per l&#39;editing del manoscritto.

1. EMS Trattamento Semi di Arabidopsis thaliana sono mutagenizzato utilizzando come agente mutageno metano solfonato di etile (EMS) 3,4, che induce nelle C-to-T genoma cambi derivanti in C / G a T / A mutazioni 5-7. <ol><li> Pesare 0,8 g di semi di Arabidopsis (circa 40.000 semi) che trasportano il marcatore fluorescente organello (specificamente, in questo studio ssGFPHDEL (sequenza segnale-GFP-HDEL tetrapeptide) è stato usato come marcatore ER). </li><li> Trasferire i semi in un tubo da 50 ml Falcon, poi aggiungere 25 ml di acqua distillata. </li><li> Aggiungere 0,2% (v / v) metano solfonato etile. </li><li> Incubare per 16 ore su oscillante miscelatore a bassa velocità. </li><li> Aspirare ed eliminare il liquido in un pallone contenente 1,0 M NaOH per inattivare l&#39;EMS. </li><li> Aggiungere 25 ml di acqua nella provetta Falcon che contiene i semi, chiudere e capovolgere 5 volte per lavare i semi; attendere che tutti i semi si sono stabiliti, quindi aspirare l&#39;acqua e gettare nel 1,0 M Na<html> OH pallone. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio fino a 10 volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere i semi in una quantità minima di acqua. </li><li> Procedere alla sterilizzazione delle sementi aggiungendo 25 ml di candeggina al 10%, si agita energicamente per 30 s. Lasciate che i semi depositerà sul fondo, quindi versare off candeggina e sciacquare con 25 ml di acqua sterile. Versare l&#39;acqua sterile e aggiungere 25 ml di etanolo al 70%. Agitare provette per 30 s. Lasciate che i semi depositerà sul fondo. Versare etanolo e sciacquare con 25 ml di acqua sterile. Ripetete due volte il lavaggio con acqua sterile, poi versate i semi su un piatto di plastica Petri contenente 3 mm Carta filtro e lasciare asciugare sotto il cofano. Conservare a 4 ° C per 2 giorni. </li><li> Piastra i semi sulla ½ MS phytagel (concentrazione media la metà di Murashige e Skoog), 150 mm Petri (circa 250-300 semi per piastra). </li><li> Crescere semi M1 sul piatto per 2 settimane, poi trapiantare nel terreno. </li><li> Raccogliere i semi M2 da singoli impianti per generare linee M1 M2 (1000 linee indipendenti). </li></ol>ove_title &quot;&gt; 2. Screening confocale delle popolazioni M2 e M3 In questa sezione descrive l&#39;osservazione di piantine con un microscopio confocale a fluorescenza o come descritto in precedenza 8. <ol><li> Sessanta semi di ogni linea M2 sono cresciuti da 7 a 10 giorni in plastica piastre di Petri, ½ MS phytagel, sulla stessa piastra vengono coltivate anche 5 piantine di EMS-non trattati (controllo). </li><li> Da cinque a dieci cotiledoni sono montati con il lato abassiale verso l&#39;obiettivo (40X) su un vetrino da microscopio e chiuso con coprioggetto. </li><li> Ogni cotiledone si osserva, dalla corticale alla regione mediale, in fluorescenza per ogni distribuzione subcellulare alterata del marcatore organello. </li><li> Impianti positivi vengono trapiantate nel terreno ed i loro semi sono raccolti e selezionati per confermare il fenotipo mutante nella generazione M3. </li><li> Rimuovere i contaminanti mutazioni di fondo attraverso backcrossing almeno tre volte a una wild-type genoma eventualmente containing il marcatore desiderato organello fluorescente. <ol><li> Dalla pianta madre, usando le forbici o pinze sottili rimuovere silique mature e fiori aperti. </li><li> Rimuovere le gemme che sono troppo piccoli da meristema. </li><li> Inserire la punta di una coppia di pinze tra petali e sepali di aprire uno bocciolo di fiore e rimuovere tutte le antere. </li><li> Utilizzando una coppia di pinze prendere un fiore aperto matura dalla pianta padre e strofinare le antere sullo stimma della pianta snervante. </li></ol></li></ol> 3. Mapping Questa sezione descrive essenzialmente come mappare una mutazione recessiva utilizzando un protocollo modificato dal Borevitz 9, che è più veloce rispetto ai metodi tradizionali di mappatura 10,11. Questo approccio utilizza array ad alta densità oligonucleotidici con la capacità di rilevare numerose tecniche singoli polimorfismi (SFP) in un singolo test 12. Utilizzando la Arabidopsis Affymetrix ATH1 serie GeneChip è possibileanalizzare i circa 24.000 geni. Un pool di F 2 individui che mostrano la mutazione viene confrontato con un pool di wild-type F 2 piante raccolte all&#39;interno della stessa popolazione segregante. Poi, la mutazione verrà mappato nella regione in cui si arricchisce il pool mutante per alleli mutanti genotipo e di conseguenza nella stessa regione il wild-type piscina risulterà arricchito per l&#39;alleli wild-type genitori 13. <ol><li> Il DNA genomico (3 mg) viene estratto dal omozigote mutante Columbia (M3) utilizzando un impianto Qiagen DNeasy Mini Kit e viene sottoposto Illumina Genome Analyzer II (GA II) 14 sequenziamento. </li><li> Il omozigote mutante Columbia (M3) è attraversata con Landsberg erecta per generare una popolazione di mappatura. </li><li> La mappatura viene eseguita su 70 fino a 100 individui F2 mostrano il fenotipo aberrante e lo stesso numero di piante F2 con un fenotipo di tipo selvatico. </li><li> Raccogliere da ogni pianta un disco foglia (0,60 mm) utilizzando un punteruolo. Ildisco di foglia devono essere raccolti dalle foglie della stessa età per essere sicuri di avere simili quantità di DNA. I campioni possono essere trattati per l&#39;estrazione genomico separatamente o in gruppi. In questo caso, è possibile raccogliere campioni 5-10 per ogni provetta Eppendorf in modo che alla fine si avrà meno provette Eppendorf da DNA genomico che deve essere estratto. </li><li> Impianto MasterPure Leaf DNA Purification Kit (Epicentre) viene utilizzato per estrarre il DNA genomico. Il DNA genomico ottenuto da ciascun campione viene quantificata con un NanoDrop. </li><li> La stessa quantità di DNA genomico da ciascun campione viene poi messo insieme fino a un totale di 300 ng (~ 30 mL) di DNA vegetale; aggiungere 60 ul 2.5X soluzione primer casuale [125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mM MgCl2, 25 mM 2-mercaptoetanolo, 750 pg / ml primer oligodeoxyribonucleotide (octamers casuali)] (Bioprime kit) e 42 microlitri di acqua (volume finale 132 pl). </li><li> DNA denaturano a&gt; 95 ° C per 5 a 10 min. </li><li> Raffreddare su ghiaccio. </li><li> Ad ogni denaturosso DNA aggiungere 15 ul miscela dNTP 10 volte con biotina dCTP [1 mM biotina-14-dCTP, dCTP 1 mM, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, dTTP 2 mM a 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Na2EDTA] (Bioprime kit), e completare con 3 polimerasi Klenow microlitri (kit Bioprime). </li><li> Incubare per una notte a 25 ° C. </li><li> Il giorno seguente, aggiungere 15 microlitri 3 M NaOAc e 400 microlitri freddo EtOH 100%; mix. </li><li> Incubare a -80 ° C per 1 ora, poi girare a 20.500 xg per 15 min, rimuovere supernatante, e lavare con 500 microlitri EtOH freddo 75%. </li><li> Spin a 20.500 xg per 10 min. </li><li> Pellets di DNA a secco a 37 ° C per 10 min e risospendere in 100 microlitri di acqua. </li><li> Utilizzare 5 microlitri per controllare resa e qualità su un gel (Figura 2). </li><li> Invia 95 microlitri di etichettatura di reazione per il wild-type e mutanti per l&#39;ibridazione Arabidopsis Genome Array GeneChip ATH1. </li><li> Gli array vengono scansionati ed i. CEL file ottenuti sono analizzati utilizzando il software R ( <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.o</a>rg /). </li><li> Installare il software R, quindi aprire il programma e incollare la seguente stringa: fonte (&quot; <a href="http://bioconductor.org/biocLite.R">http://bioconductor.org/biocLite.R</a> &quot;) biocLite () Poi premere il tasto-questo ritorno installerà i pacchetti standard (Bioconductor <a href="http://www.bioconductor.org">http://www.bioconductor.org</a> ). </li><li> In una nuova cartella sul desktop, scaricare dal seguente sito Web ( <a href="http://www.naturalvariation.org/methods">http://www.naturalvariation.org/methods</a> ) i file: readcel.R SFP.R Map.R ath1V5.RData ColLerCEL.zip Il ColLerCEL.zip file deve essere decompresso ed i file risultanti incollato nella nuova cartella. </li><li> Rinominare i dati ottenuti dall&#39;esperimento GeneChip in wildtype.CEL e mutant.CEL. </li><li> Copiate ora i tuoi dati GeneChip (wildtype.CEL emutant.CEL) nella cartella. </li><li> Apri R, a) per Mac: fare clic su &quot;Misc&quot; e quindi fare clic su &quot;Cambia directory di lavoro.&quot; b) per PC: fare clic su &quot;File&quot; &quot;Cambia directory&quot; e poi </li><li> a) per Mac: selezionare la cartella contenente i file. Fare clic su &quot;Area di lavoro&quot;, &quot;spazio di lavoro Load File&quot; e selezionare ath1V5.RData, b) per PC: selezionare la cartella contenente i file di cui sopra, cliccare su &quot;File&quot;, poi &quot;Load workspace&quot; e selezionare ath1V5.RData. </li><li> ReadCEL.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l&#39;intero testo di R. </li><li> SFP.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l&#39;intero testo di R. </li><li> Map.R Apri utilizzando il Blocco note e copiare l&#39;intero testo di R. </li><li> Nella finestra della console verrà visualizzato il seguente messaggio: Cromosoma x limita Mb yz I geni della ricerca a TAIR incollare questo link 3 <a href="http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y&amp;end=z">http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&amp;chr=x&amp;start=y</a>&amp; End = z </li><li> Copia e incolla il link nel proprio browser internet. Apparirà una finestra e chiedere di aprire o salvare il file, si dovrebbe selezionare Salva. Scegli un nome di file e fissare l&#39;estensione &quot;. Xls&quot;, quindi fare clic su Salva. </li><li> Aprire il file &quot;. Xls&quot; dove si possono trovare le coordinate per il vostro mutante (il risultato è rappresentato graficamente in Figura 3). </li><li> All&#39;interno dell&#39;area mappata nel Illumina assemblato legge del genoma mutante identificare specifiche transizioni EMS quattro tra i polimorfismi a singolo nucleotide. Completano il fenotipo mutante mediante trasformazione con il gene wild type (s) utilizzando le procedure standard 15. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi La figura 1 mostra l&#39;approccio utilizzato per l&#39;identificazione di un mutante di percorso secretorio di screening utilizzando la microscopia confocale. Figura 2 mostra una tipica preparazione di DNA genomico marcato per ibridazione matrice. In figura 3, un tipico risultato atteso dopo l&#39;analisi dei dati ottenuti dalla Array GeneChip Arabidopsis Genome ATH1 viene presentato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig1.jpg" /> Figura 1. Piante di Arabidopsis transgeniche esprimenti ssGFPHDEL (ER marker) (1) sono stati coltivati ​​per produrre abbastanza semi per EMS trattamento (2). I semi trattati con EMS sono stati poi seminati per generare piante M1 (3). Ogni pianta M1 rappresenta una linea diversa e semi sono stati raccolti separatamente da ciascuno di essi. Seme M2 sono state piastrate su substrato ½ MS (4) e poi sottoposti a screening per difetti di morfologia ER tramite microscopia confocale (5). Durante la proiezione abbiamo trovato piante che conserva la wild-type morfologia ER (6) e le piante che mostrano fenotipi difettosi ER (7). Queste piante sono state coltivate per ottenere la generazione M3 e per confermare il fenotipo (8). Il DNA genomico di pianta M3 è stato utilizzato per Solexa Illumina sequenziamento (a). La stessa piantaè stato utilizzato anche per gli incroci con Ler-peso per ottenere la popolazione F2 mappatura (b). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig2.jpg" /> Figura 2. Reazioni Bioprime etichettatura random (5 pl di 100 pl) sono stati caricati su gel di agarosio 1%. Lane, uno è da un pool di piante F2 wild-type, e Lane b è da un pool di piante mutanti F2. (Marker è 1 Kb DNA ladder-N3232, da NEB). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3809/3809fig3.jpg" /> Figura 3. La figura rappresenta un esempio di mappatura delle Col-0 mutazione utilizzando Arabidopsis GeneChip ATH1 Genome Hybridization Array. La mutazione in questo esempio è situato sul cromosoma 1 delimitato, da barre verticali. Le barre orizzontali rappresentano le soglie per il rilevamento.

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	<li>Marti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missense+mutation+in+the+vacuolar+protein+GOLD36+causes+organizational+defects+in+the+ER+and+aberrant+protein+trafficking+in+the+plant+secretory+pathway.">A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).</li><li>Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+the+spatial+and+dynamic+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+and+Golgi+apparatus+is+influenced+by+the+integrity+of+the+c-terminal+domain+of+RHD3,+a+non-essential+GTPase.">Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase.</a> The Plant Journal. , (2011).</li><li>Kim, Y., Schumaker, K. 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Non abbiamo nulla da rivelare.

Qui descritto un microscopio confocale a base di screening per l&#39;identificazione dei mutanti endomembrane. Questo approccio può essere facilmente estesa ad altri organelli della cella per cui specifici marcatori proteici fluorescenti sono disponibili. Lo schermo si basa sulla individuazione di mutanti che mostrano una distribuzione aberrante del marcatore fluorescente o in organello bersaglio o organelli che non dovrebbero contenere il marcatore. Rispettivamente, questi mutanti rappresentano popolazioni in cui è c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Ethylmethane solfonato </td><td> Sigma </td><td> M0880 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> JT Baker </td><td> 3722-05 </td></tr><tr><td> Murashige Skoog basali medi w Gamborg vitamine </td><td> Phyto technolog labor </td><td> M404 </td></tr><tr><td> Phytagel </td><td> Sigma </td><td> P8169-1Kg </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Maestro vegetale puro foglia DNA kit di purificazione </td><td> Epicentre </td><td> MPP92100 </td></tr><tr><td> Bioprime DNA sistema di etichettatura </td><td> Invitrogen </td><td> 18094-011 </td></tr><tr><td> Alcohol 200 prove </td><td> Decan laboratori inc. </td><td> 2716 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> JT Baker </td><td></td></tr><tr><td> Gene Chip ATH1 Arabidopsisarray di genoma </td><td> Affymetrix </td><td> 900385 </td></tr><tr><td> Provette Falcon 50 mL </td><td> corning </td><td> 430290 </td></tr><tr><td> Provette Eppendorf 1,5 mL </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Carta da filtro 90 millimetri </td><td> Whatman </td><td> 1001090 </td></tr><tr><td> Bilancia analitica </td><td> Mettler Toledo AB54-S </td><td> na </td></tr><tr><td> Contalitri volumetrico (wave) shaker </td><td> Heidolph Polymax 1040 </td><td> na </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf 5417-R </td><td> na </td></tr></tbody></table>

fluorescence-microscopy screening and next-generation sequencing: useful tools for the identification of genes involved in organelle integrity

Questo protocollo descrive un microscopio a fluorescenza basato su uno screening di piantine di Arabidopsis e descrive come mappare le mutazioni recessive che alterano la distribuzione subcellulare di uno specifico tag marker fluorescente in via secretoria. Arabidopsis è un potente modello biologico per gli studi genetici a causa della sua dimensione del genoma, tempo di generazione, e la conservazione dei meccanismi molecolari tra i regni. La matrice genotipizzazione come un approccio per mappare la mutazione in alternativa al metodo tradizionale basato su marcatori molecolari è vantaggiosa poiché è relativamente veloce e può consentire la mappatura dei diversi mutanti in un lasso di tempo molto breve. Questo metodo consente l&#39;identificazione di proteine ​​che possono influenzare l&#39;integrità di eventuali organello nelle piante. Qui, come esempio, si propone una schermata per mappare geni importanti per l&#39;integrità del reticolo endoplasmatico (ER). Il nostro approccio, tuttavia, può essere facilmente estesa ad altri organelli cellulari vegetali(Si veda per esempio 1,2), e rappresenta quindi un passo importante verso la comprensione delle basi molecolari che regolano le altre strutture subcellulari.

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Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l&#39;identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l&#39;integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

fluorescence-microscopy-screening-next-generation-sequencing-useful

Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  Michigan State University. Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

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Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Ricerca

Genetica

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Biochimica

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Medicina

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Neuroscienze

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in cell biology. Many phenomena cannot be explained by in vitro analysis in simplified systems and need additional structural information in situ, particularly in the range between 1 nm and 0.1 &#181;m, in order to be fully understood. Here, electron spectroscopic imaging, a transmission electron microscopy technique that allows simultaneous mapping of the distribution of proteins and nucleic acids, and an expression tag, miniSOG, are combined to study the structure and organization of DNA double-strand break repair foci.

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine ​​di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

In Vitro e In Vivo rilevamento di Mitophagy in cellule umane, C. Eleganse topi

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

Visualizzazione di miniSOG Tagged proteine di riparazione del DNA, in combinazione con Electron spettroscopica Imaging (ESI)

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

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