Nota: Per mantenere condizioni di coltura sterili, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono effettuate utilizzando pratiche di laboratorio sterile e condotto sotto una cappa a flusso laminare. Prima di iniziare, assicurarsi che i media sono equilibrati a 37 ° C e opportunamente gasati. Preparazione Geltrex rivestita Piatti Cultura Nota: vedi appendice per l&#39;uso di piatti CELLstart cultura rivestito. <ol><li> Scongelare un tubo di Geltrex (1 ml) lentamente a 2-8 ° C e diluire 1:100 in 99 ml di Knockout D-MEM/F-12. Mescolare delicatamente la soluzione. Nota: alcune linee di cellule iPS possono richiedere una diversa diluizione Geltrex per una crescita ottimale. Vedi appendice per le diluizioni alternative. </li><li> Coprono l&#39;intera superficie di ogni piatto cultura con la soluzione Geltrex (1 mL per un piatto da 35 mm, 1,5 ml per un piatto di 60 mm). </li><li> Sigillare ogni piatto con Parafilm contro l&#39;essiccamento e incubare i piatti per 1 ora a 37 ° C. Nota: A questo punto si può memorizzare il Geltrex rivestite piatti di cultura a 4 ° C per un massimo di 1 mese. Sigillare ogni piatto con Parafilm per evitare che il Geltrex si secchi. </li><li> Prima di utilizzare, trasferire il Geltrex rivestite piatti di una cappa a flusso laminare e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente (circa 1 ora). </li></ol> Preparazione completa alimentatore-Free SR KnockOut Media <ol><li> Per preparare 1 mL di 10 mg / ml soluzione di base FGF, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino a 6 mesi. <table border="0"><tbody><tr><td> Di base FGF </td><td> 10 mcg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% di BSA </td><td> 10 L </td></tr></tbody></table> Nota: BSA può essere sostituito con HSA o SR Knockout alla stessa concentrazione. </li><li> Per preparare 50 ml di 2 mg / ml soluzione dispasi, asettico miscelare i componenti elencati di seguito. Filtrare la soluzione sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispasi </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Per preparare 100 mL di SR KnockOut completo alimentatore-Free (KSR-FF) asetticamente combinare i componenti elencati nella tabella sottostante. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione magazzino </td><td> Concentrazione finale </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (n ° cat. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR (n ° cat. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (n ° cat. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> bFGF (n ° cat. PHG0024). </td><td> 10 mcg / ml </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 l </td></tr></tbody></table> Si può memorizzare il KSR-FF medio a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Poco prima di pre-raggiunga l&#39;equilibrio completo a temperatura e gas, in modo asettico aggiungere il volume richiesto di 2 mercaptoetanolo (55 concentrazione magazzino mm) per una concentrazione di 0,1 mM finale. Ad esempio, per preparare 100 ml di KSR-FMedio F aggiungere 182 microlitri di 55 mM di 2-mercaptoetanolo (diluizione 1:550) In alternativa, il 2-mercaptoetanolo possono essere aggiunti al mezzo di 1X completato e conservato a 2-8 ° C per un massimo di una settimana. </li></ol> Preparazione di congelamento / Crioconservazione Media Il mezzo di crioconservazione è composto da due mezzi di comunicazione; Media congelamento A e B. Media congelamento Essi sono aggiunti alle cellule in tempi diversi e devono rimanere separati. Ciascuno di essi è il 50% del volume totale delle medie Crioconservazione necessario. Il volume totale delle medie Crioconservazione necessario è di 1 ml per ogni flacone da congelare. Un 90% piatto confluenti 60mm hESC può essere utilizzato alla banca 2 flaconi di hESC nei media crioconservazione. Preparare un volume sufficiente di ogni media di congelamento con un extra di 2-5mL per assicurare eccedenza. <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Media A (50% del volume finale): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Congelamento Media B (50% del volume finale): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% di DMSO </td></tr></tbody></table> Esempio: Se siete congelamento 20 fiale di cellule, avrete bisogno di 20 mL di media crioconservazione. Aggiungere 4 ml di carico eccessivo per un totale di Media Crioconservazione 24ml. Ciò significa che avrete bisogno di 12 ml di Media congelamento A (50% di 24ml) e 12 ml di B Media di congelamento (50% di 24ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Congelamento Media A (12 ml): </td><td> 6 ml DMEM/F12 </td><td> 6 ml KSR </td></tr><tr><td> Congelamento Media B (12 ml): </td><td> 9,6 mL DMEM/F12 </td><td> 2,4 mL di DMSO </td></tr></tbody></table> La composizione finale del Medio Crioconservazione DMEM/F12 è del 65%, 25% KSR, e il 10% di DMSO. Cryopreserving iPSCs <ol><li> Preriscaldare il volume richiesto di dispasi in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Fare riferimento alla Tabella 1 riportata di seguito per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Pre-equilibrare il volume di KSR-FF in A ° C 37 bagnomaria per 15 min. Fare riferimento a 1below tabella per i dettagli sui volumi richiesti. </li><li> Aspirare il terreno trascorso dalla nave cultura con una pipetta, e lavare le cellule due volte con D-PBS. </li><li> Aggiungere delicatamente preriscaldato soluzione dispasi alla nave cultura (ad esempio, 1 mL di soluzione dispasi per 60 mm piatto di cultura). Agitare il recipiente di coltura per ricoprire l&#39;intera superficie delle cellule. </li><li> Incubare il recipiente di coltura a 37 ° C per 3 minuti. </li><li> Rimuovere il recipiente dal termostato, aspirare la soluzione dispasi, e lavare delicatamente le cellule con D-PBS. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule dalla superficie del piatto cultura utilizzando un raschietto cellula, e trasferire le cellule in una provetta sterile centrifuga 15ml. </li><li> Lavare il piatto cultura due volte con KSR-FF, dolcemente &quot;spruzzo off&quot; tutte le cellule che non si sono staccati. Piscina di risciacquo medio con le cellule nel tubo 15ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. </li><li> Con attenzione aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule e smaltirlo. </li><li> Preparare una quantità sufficiente di cryovials. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti. </li><li> Picchiettare lievemente il tubo, per rimuovere completamente il pellet dal fondo del tubo e risospendere le cellule in A. Medio congelamento [pipettando gentilmente su e giù con un 5-mL sierologici pipetta]. A seguito di sospensione uniforme di grumi, aggiungere uguale volume di B Media congelamento ad esso, in maniera goccia a goccia, mentre rimestando delicatamente la sospensione cellulare per mescolare. Nota: A questo punto, le cellule sono in contatto con DMSO, e il lavoro deve essere eseguito in modo efficiente. Una volta che le cellule sono in contatto con DMSO, dovrebbero essere aliquotati e congelato entro 2-3 minuti. </li><li> Aliquota 1 ml di sospensione cellulare in ogni provetta Microbank ™. </li><li> Introdurre rapidamente le provette in un gelido Mr. [di congelare rapidamente] e trasferirlo a -80 ° C durante la notte. </li><li> Dopo una notte di stoccaggio a -80 ° C, trasferire le cellule a un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. </li></ol> IPSC disgelo flaconcino e il recupero delle cellule Nota: KSR-FF può essere sostituito con KSR contenenti MEF condizionata medio, o medio KSR per l&#39;uso con alimentatori. Vedere l&#39;appendice per le istruzioni per la preparazione dei media. Preriscaldare 10 ml di KSR-FF media in un tubo da 50 ml. <ol><li> Equilibrare la quantità appropriata di Geltrex rivestite piatti a temperatura ambiente ed aspirare il liquido dai piatti poco prima di placcaturar cellule. </li><li> Rimuovere con cura il hESC (o IPSC) fiala da serbatoio di stoccaggio di azoto liquido. </li><li> Rapido disgelo fiala congelata di cellule in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C, fino a poco un piccolo pezzo rimane congelato nel flacone. </li><li> Spray fiala con il 70% di isopropanolo per decontaminare e trasferimento alla cappa sterile coltura di tessuti. </li><li> Trasferire asetticamente l&#39;intero contenuto del flacone in un tubo da 15 ml con una pipetta da 5 ml. </li><li> Sciacquare la fiala con 1 ml di KSR-FF e aggiungere questo al tubo da 15 ml per centrifuga. </li><li> Lentamente, aggiungere 4 ml di KSR-FF goccia a goccia per le cellule nel tubo 15 ml conica. Mentre l&#39;aggiunta del mezzo, spostare delicatamente il tubo avanti e indietro per mescolare le cellule. (Questo riduce shock osmotico alle cellule). </li><li> Centrifugare il tubo di 15 ml con la sospensione cellulare a 1000rpm (200 x g) per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Con attenzione aspirare e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in fase di pre-riscaldato KSR-FF (ad esempio 4mL/60 piatto mm) con una pipetta da 5 ml e pipettare delicatamente le cellule su e giù fino a pellet cellulare è completamente dispersa. Una vitalità maggiore del 70% è previsto, se la vitalità è inferiore al 70%, può richiedere più tempo per le cellule di raggiungere confluenza. </li><li> Utilizzando la medesima pipetta, trasferire la sospensione cellulare goccia a goccia a Geltrex rivestite piatto cultura pre-equilibrati a temperatura ambiente. </li><li> Porre la capsula la cultura in un incubatore a 37 ° C, con un atmosfera umidificata da 4 a 6% di CO 2 in aria. Con attenzione nave vortice in direzione nord a sud, da est a ovest modello per distribuire uniformemente le cellule. </li><li> Delicatamente liquido cambiare il piatto cultura 24 ore post-disgelo e quindi giornalmente per rimuovere i detriti cellulari e per fornire nutrienti fresco fino a quando il piatto è circa il 70-80% confluenti. Per la cultura continua e passaging delle cellule iPS, fare riferimento al nostro protocollo dal titolo &quot;Alimentazione-Free Cultura e Passaging di cellule umane iPS usando completa sostituzione siero KnockOut alimentatore-Free Media&quot; </li></ol> Risultati attesi Le cellule dovrebbero essere circa il 70-80% confluenti prima di crioconservazione. Dispasi risultati digestione nel curling e piegatura delle colonie lungo i margini colonia. Dopo la raccolta le cellule sono congelati come piccoli ammassi in mezzi crioconservazione. Una volta che il flacone è scongelato, le cellule recuperare e allegare alla pre-rivestite piatto come grumi di piccole dimensioni. Crescono rapidamente porta a un piatto confluenti in 5-6 giorni. Tabella 1 - Volumi consigliati <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> 35 millimetri Piatto </td><td> Piatto 60 millimetri </td><td> Dish 100 millimetri </td></tr><tr><td> Completa KnockOut SR media </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Geltrex Soluzione </td><td> 1 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 mL </td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 ml </td><td> 3-4 ml </td></tr><tr><td> D-PBS per il risciacquo </td><td> 2 ml </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Si prega di <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">cliccare qui per vedere l&#39;appendice</a> .

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li><li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li><li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells.">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li><li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes.">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li><li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li></ol>

Gli autori di questo articolo sono impiegati da Life Technologies che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Note: see appendix for the use of alternative DMEM products GlutaMAX-I (Cat. No. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human recombinant protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Note: see appendix for alternative passaging methods</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Tissue Culture Hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath set at 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Tissue Culture treated dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol freezing containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Cryovials</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cryopreserving and recovering of human ips cells using complete knockout serum replacement feeder-free medium

La scoperta nel 2006 che fibroblasti umani e mouse potrebbe essere riprogrammato per generare cellule iPS 1-3 con caratteristiche molto simili alle cellule staminali embrionali ha creato una nuova fonte preziosa di cellule pluripotenti per la scoperta di farmaci, terapia cellulare, e la ricerca di base. Mezzi di comunicazione GIBCO e reagenti sono stati in prima linea nella ricerca sulle cellule staminali pluripotenti da anni. Knockout DMEM integrato con sostituzione Knockout siero è il media di scelta per la crescita delle cellule staminali embrionali e ora di cellule iPS cultura 3-9. Il gold standard del sistema dei media può ora essere utilizzato per alimentazione priva di cultura con l&#39;aggiunta di Cocktail SR Factor Knockout crescita. Tradizionale ES umane e metodi di coltura delle cellule iPS richiedono l&#39;uso di mouse o strati alimentatore fibroblasti umani, o l&#39;alimentatore condizionata media. Questi metodi sono cultura alta intensità di lavoro, difficili da scalare ed è difficile mantenere anche le cellule indifferenziate a causa delle condizioni indefinito. Invitrogen ha sviluppato SR Knockout Cocktail fattore di crescita per consentire di transizione facilmente i fianchi e le colture cellulari hES alla rinfusa, senza pur mantenendo l&#39;uso di SR Knockout.

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Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Questo protocollo descrive la procedura dettagliata per cryopreserving cellule umane iPS nel medio KnockOut crioconservazione SR ed il recupero di queste cellule in completo alimentatore KnockOut gratuito SR (KSR-FF), medio o alimentatore a base di medie SR KnockOut.

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

cryopreserving-recovering-human-ips-cells-using-complete-knockout

Universidad de Cartagena UDEC

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Biology

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Video: Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). We have devised a reprogramming strategy in which these four transcription factors are expressed from doxycycline (dox)-inducible lentiviral vectors (Brambrink et al., 2008). Using these inducible constructs, we can derive induced pluripotent stem (iPS) cells from mouse embryonic fibroblasts (MEFs). In this video, we demonstrate the procedure for the generation of inducible lentiviruses that express the four transcription factors and show how to infect MEFs with these viruses in order to produce iPS cells. By using inducible lentiviruses, the expression of the four factors in controlled by the addition of doxycyline to the culture medium. The advantage of this system over the traditional retroviral infection is the ability to turn the genes on and off so that the kinetics of reprogramming and gene expression requirements can be analyzed in detail.

This video shows the procedure for generating induced pluripotent stem cells using inducible lentivirus that express Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4.

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l&#39;espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

Ricerca

Biologia

Small-scale Propagation of Human iPSCs in Serum-free Conditions for Routine Immunocytochemical Characterization

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.

Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient ...

Biologia dello sviluppo

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Bioingegneria

Differenziazione indotta di cellule staminali pluripotenti mediante un sistema di coltura automatizzato

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Autore in primo piano: Automazione della coltura iPSC per una maggiore riproducibilità 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Cryopreserving e recupero di cellule umane iPS usando KnockOut Completa alimentatore-Free siero sostituzione Media

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Capitoli in questo video

Generare cellule iPS dal MEF attraverso l'espressione forzata di Sox-2, Oct-4, c-Myc e Klf4

Propagazione in piccola scala di iPSCs umano in siero-liberi Condizioni di routine Caratterizzazione immunocitochimica

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

Alimentatore-Free adattamento, la cultura e Passaging di cellule IPS utilizzando Completa alimentatore-Free siero sostituzione KnockOut Media

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell'epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell'epitelio pigmentato retinico