Samir Hamdan aiutato nello sviluppo di questa tecnica. E. coli sono proteine ​​dal laboratorio del Prof. Nick Dixon, proteine ​​dell&#39;Università di Wollongong, e T7 sono dal Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. Il lavoro è supportato dal National Institutes of Health (GM077248 a AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Prima di eseguire una singola molecola esperimento replica, alcuni materiali devono essere preparate in anticipo. 1. DNA replica Template Il substrato per la reazione di replica è un biotinilato, coda M13 cerchio di rotolamento preparato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare 1,2. Materiali: M13mp18 DNA a singolo filamento, biotinilato fondo oligonucleotidi coda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), la DNA polimerasi T7, blocco di calore, fenolo / alcool isoamilico / cloroformio <ol><li> Temprare il oligo biotinilato coda alla M13 con l&#39;aggiunta di 10 volte l&#39;eccesso di oligo in tampone TBS (330 nM coda di oligo, 33 nM M13). </li><li> Scaldare la miscela a 65 ° C nel blocco di calore. Una volta riscaldato, ruotare il blocco fuoco spento e consentire il raffreddamento lento a temprare correttamente il primer. </li><li> Aggiungere la M13 pronti a una miscela di 64 nM T7 polimerasi del DNA e la replicazione del buffer T7 contenente dNTP e MgCl 2. </li><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 12 minuti e spegnere con 100 mM EDTA. </li><li> Purificare la compilati nel DNA del prodotto con fenolo / cloroformio / alcool isoamilico estrazione e Dializzare nel buffer TE o altri buffer di stoccaggio e determinare la concentrazione del DNA (Back-estrarre ogni fase organica di recuperare eventuali residui innescato M13). </li><li> Una iterazione di preparazione modello può facilmente rendere diversi ml di concentrazione nanomolari modello, sufficiente per centinaia di migliaia di singola molecola esperimenti. </li></ol> 2. Coprivetrini funzionalizzati Per fissare il DNA alla coprioggetto di vetro, il vetro viene prima funzionalizzati con un aminosilane, che viene poi accoppiato a molecole PEG biotinilato. Questo rivestimento consente di ridurre le interazioni non specifiche di DNA e proteine ​​replica con la superficie di 1,3. Materiali: coprioggetto di vetro, barattoli di colorazione, 3-amminopropiltrietossisilano, metossi-PEG5k NHS-estere, biotina-PEG5k-NHSester, acetone, KOH 1M, etanolo, Forno, sonicatore Bagno <ol><li> Pulire accuratamente i coprioggetti vetro mettendoli in colorazione vasi e riempire i vasi con etanolo. Con ultrasuoni per 30 minuti e sciacquare i vasi e riempire con 1 M KOH. Ultrasuoni per 30 minuti Ripetere i due lavaggi. </li><li> Per la reazione di funzionalizzazione primo, tutte le tracce di acqua devono essere rimosse. Riempite i barattoli con acetone e ultrasuoni per 10 min. Sciacquare i vasetti di nuovo con acetone. </li><li> Preparare un 2% v / v soluzione del reagente silano in acetone. Aggiungi ai contenitori per i lavaggi e agitare per 2 minuti. Questa reazione coppie del gruppo alcossi del aminosilane al vetro, lasciando una ammina reattiva per il passo successivo accoppiamento. Spegnere la reazione con un eccesso d&#39;acqua. </li><li> Asciugare il coprioggetto dalla loro cottura a 110 ° C in forno per 30 minuti. </li><li> Preparare un 50:1 metossi: biotina miscela PEG in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Obiettivo per circa lo 0,2% w / v PEG biotinilato. </li><li> Pipettare 100 ul della miscela PEG su un vetrino asciutto silanizzata e posto un altro coprioggetti sopra. Compreso un distanziatore coprioggetto di vetro permette la separazione delle lamelle. </li><li> Incubare i coprioggetti nella soluzione di PEG per 3 ore, poi separare ogni coppia di coprioggetto e lavare a lungo con acqua. Fare attenzione a tenere i coprioggetti funzionalizzate verso l&#39;alto come unico lato una volta saranno rivestiti con PEG. </li><li> Asciugare il coprioggetto e conservare sotto vuoto. Le superfici sono stabili per almeno un mese, in modo da decine di coprioggetto può essere fatta in un batch ed utilizzato secondo necessità. </li></ol> Questi materiali devono essere fatte prima del tempo, e poi utilizzati per ogni esperimento. Per iniziare a sperimentare ogni singola molecola, iniziare l&#39;assemblaggio della camera di flusso. 3. Flusso Camera di preparazione L&#39;esperimento viene eseguita utilizzando una camera di flusso semplice costruito con un coprioggetto funzionalizzati, nastro biadesivo, una diapositiva quarzo e tubi. Una camera di flusso viene preparato per ogni singola molecola 1,4 esperimento. Materiali: su entrambi i lati del nastro, lametta, scivolo al quarzo con fori per tubi, ad asciugatura rapida epossidica, coprioggetto funzionalizzati (vedi sopra), soluzione Streptavidina (25 ml di 1 mg / ml in PBS), tubi, buffer di blocco (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Iniziare a collocarlo 20-25 mL di tampone di bloccaggio in un essiccatore per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria per fasi successive. </li><li> Prendete un PEG-funzionalizzati coprioggetto e diffusione di PBS-125 una soluzione diluita di streptavidina sulla superficie. Lasciare questo ad incubare per 20 minuti durante la preparazione di altre parti della camera, che permette di legare streptavidina biotins superficie. </li><li> Tagliare un pezzo di doppio latoNastro d in base alle dimensioni della diapositiva quarzo. Segnare la posizione dei fori tubo sul nastro con una matita in modo che il contorno della camera di flusso si possono trarre sul nastro (1 mg / mL). </li><li> Fai di 2 mm di larghezza rettangolo intorno ai fori. Questo servirà come canale di flusso, in modo da essere sicuro di fare i lati dritti e lasciare spazio attorno al tubo di ingresso e di uscita. Se lo si desidera, più canali o dimensioni diverse possono essere utilizzati. </li><li> Tagliare lungo il contorno disegnato, rendendo dritto, tagli netti per assicurarsi che non sporge adesivo nel canale. </li><li> Pulire il quarzo accuratamente con acetone o etanolo per rimuovere l&#39;adesivo dalla costruzione precedente cella di flusso. </li><li> Trova la migliore allineamento del contorno canale, rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con attenzione il nastro sul vetrino di quarzo. Prestare attenzione ad allineare il nastro correttamente, come i fori di ingresso e di uscita devono rimanere sbloccato. </li><li> Tagliare le lunghezze dei tubi per l&#39;ingresso el&#39;uscita della cella di flusso. Essa aiuta a tagliare l&#39;estremità del tubo a circa 30 ° di inclinazione in modo che il tubo non si stampa contro il fondo piatto della camera. Posizionare i tubi su una sorta di sostegno di sospenderli per un facile montaggio della cella di flusso nelle fasi successive. </li><li> Sciacquare la streptavidina rivestite coprioggetto accuratamente con acqua e asciugare con aria compressa. Ricordati che solo un lato è funzionalizzato; fare attenzione a non trasformare il coprioggetto sopra. Rimuovere l&#39;altro lato del supporto a nastro e posto il vetrino di quarzo sul vetrino. </li><li> Premere leggermente il vetrino per far uscire l&#39;aria intrappolata nel adesivo. Questo aiuterà a evitare eventuali bolle d&#39;aria di entrare nel canale di flusso. </li><li> Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e tenuta in posizione con resina epossidica. Questo deve asciugare per qualche minuto. </li><li> Una volta asciutto, cominciano bloccando la superficie tirando alcuni dei buffer degasato blocco attraverso uno dei tubi. Un 21-gauge si adatta perfettamente all&#39;interno del tubo di 0,76 mm. Stanare un paio di volte per eliminare le bolle d&#39;aria, e permettere la camera di incubazione per almeno mezz&#39;ora. </li></ol> 4. Singola molecola di replica Experiment Materiali: camera di flusso preparati, SYTOX Orange, microscopio TIRF, 532 nm laser, telecamera CCD, computer con software di acquisizione delle immagini, Rolling-cerchio substrato DNA, proteine ​​di replica <ol><li> Dopo la cella di flusso è stato bloccato, tutto è pronto per iniziare la singola molecola esperimento. </li><li> Prendere la cella di flusso e posizionarlo sul palco microscopio. Tenere la camera in posizione con clip palco ed essere sicuri che il canale di flusso è posizionato dritto lungo l&#39;asse y. </li><li> Collegare la cella tubo di flusso in uscita per la pompa a siringa con un più grande tubo connettore diametro o un ago. Posto l&#39;ingresso nel tampone di bloccaggio e tirare indietro la siringa per rimuovere l&#39;aria nel tubo. Un film delicato del tubo di uscita aiuterà chiaro eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella cella di flusso. </li><li> Diluire il modello del DNA magazzino a 25 pM in 1 ml di tampone di bloccaggio. Flusso nella camera a portata moderata per consentire una buona copertura della superficie del DNA. 0,025 ml / min per 30 minuti funziona bene. Questo può essere variata in base al numero di molecole di DNA sono sulla superficie di ciascun lotto di coprioggetto o quanti sono voluti per l&#39;esperimento. </li><li> Una volta che il DNA è, lavare il DNA in eccesso con un tampone di bloccaggio. Lavare per almeno 200 volumi di flusso di cellule per sbarazzarsi di tutto il DNA libero. </li><li> Iniziare degasaggio il buffer di replica. Per la E. esperimenti replica coli, farlo a 37 ° C per ridurre il rischio di bolle nella camera di flusso riscaldato. </li><li> Accendere il laser e telecamera. Il CCD raffreddata deve raggiungere la temperatura prima di poter essere utilizzato. </li><li> Se si esegue a 37 ° C esperimento, girare la stufa. Assicurarsi che l&#39;obiettivo è a contatto con la cella di flusso o sarà un dissipatore di calore in seguito. </li><li> Dopo il lavaggio e degasaggio, la reazione può essere preparato. Nucleotidi mix, DTT, e SYTOX nel buffer di replica. Quindi aggiungere proteine ​​e mescolare delicatamente. </li><li> Flusso della miscela di reazione nella cella di flusso. Questa velocità di flusso deve essere sufficiente per allungare dsDNA. Per un 2-mm di larghezza, 100-micron canale di flusso alto 0,04 ml / min funziona bene. </li><li> Attendere che la miscela di entrare nella camera e iniziare imaging. Un buon consiglio è quello di spostare il campo di vista a lato del canale e concentrarsi sul materiale adesivo. Questo farà sì che sono vicino alla superficie messa a fuoco. </li><li> Regolare potenza del laser, messa a fuoco microscopio, e l&#39;angolo TIRF. Mantenere il potere basso per evitare qualsiasi photocleavage del DNA macchiato. Acquisire al 05/01 fotogrammi / secondo per diversi minuti a seconda del tasso di replicazione del DNA. Se lo si desidera, ripetere per ottenere traiettorie replica più o passare ad un nuovo campo per vedere di più molecole. </li><li> Dopo la miscela di reazione è quasi vuoto, è una buona idea di flusso in più tampone con SYTOX per vedere altri campi di vista. Prendendo immagini multiple di diverse molecole replicato fornisce statistiche per la determinazione processività. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Molecole di replicazione attiva sono facilmente visibili come linee crescente di DNA macchiato. Nei nostri esperimenti, che scorre 25 pM del substrato M13 dà 100-1000 molecole in una, 60x 125 micron x 125 micron campo di vista (Figura 1). Esecuzione di esperimenti di replica utilizzando la E. proteine ​​coli replisoma a 37 ° C (vedi Materiali per i dettagli) dà molecole 5-50 replicare per campo di vista. A concentrazioni equivalente del replisoma T7, che avvia sul substrato molto più efficiente, osserviamo&gt; 70% delle molecole in un campo di replicare. Queste condizioni producono una densità del prodotto così alto che le molecole individuali sono difficili da risolvere ed analizzare, per cui gli esperimenti vengono eseguiti T7 a concentrazioni inferiori di proteine. Analisi dei dati: per ottenere dati di frequenza, è sufficiente tracciare il punto finale del DNA in funzione del tempo e calcolare la pendenza (Figura 2). Per processività, determinare la lunghezza totale del DNA. Entrambi questi numeri dovranno essere convertiti in coppie di basi. Prima di eseguire l&#39;esperimento, si dovrebbe sapere la dimensione in pixel della fotocamera al proprio ingrandimento. Per la conversione basepair, una buona stima è semplicemente convertendo in base alla lunghezza cristallografica del DNA, 2,9 bp / nm. Tuttavia, il flusso laminare non sarà completamente allungare il DNA, così una calibrazione lunghezza del DNA deve essere effettuata prendendo un DNA noto lunghezza, ad esempio, 48.502 bp λ DNA, allegando alla cella di flusso con un oligo biotinilato e misurazione della SYTOX macchiato di lunghezza a la portata utilizzata per l&#39;esperimento di replica. Determinazione del numero di coppie di basi / pixel consente il calcolo preciso dei tassi di replicazione e processivities. Prendendo numerose immagini e filmati fornirà un gran numero di molecole di prodotto, permettendo di tracciare distribuzioni votare e processività (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (Da Rif. ​​1.) A), Cartoon del rolling-cerchio saggio di replica. (SA, streptavidina). Leader filo-sintesi si estende la coda che collega il cerchio e la superficie. La coda viene convertito in dsDNA dalla polimerasi filamento in ritardo e si estendeva dal flusso laminare. b) Esempio di campo di vista con SYTOX arancia e 532 nm di eccitazione. Piccole macchie fluorescenti sono legati, non replicate substrati. Si noti la estrema lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo (ogni cella di flusso contiene&gt; 5000 tali campi). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adattato da Rif. ​​1). A, b) Kymographs molecole tipiche di replicare da T7 (a) ed E. coli (b) esperimenti. c) traiettorie Endpoint di molecole da a) e b) tracciati in funzione del tempo. Traiettorie sono dotati di regressione lineare per ottenere tassi di replica. Esempi riportati sono 99,4 bp s -1 e 467,1 pb s -1. d) le distribuzioni Lunghezza di prodotti per la replica, in forma con singolo decadimento esponenziale di ottenere processività: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) le distribuzioni di frequenza delle traiettorie singola molecola, in forma con gaussiane singolo. Significa: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

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	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Un controllo critico sta esaminando l&#39;effetto della macchia, SYTOX Orange, sulle proteine ​​replica di interesse. Un modo semplice per farlo è quello di eseguire l&#39;esperimento di replica nella cella di flusso, come descritto, ma con l&#39;omissione di SYTOX. Dopo la miscela di reazione è fluito attraverso la camera, aggiungere tampone con SYTOX a macchia di DNA ed esamina la ripartizione lunghezza delle molecole replicati. In alternativa, le reazioni di massa standard può essere utilizzato per verificare eventuali effetti di SYTOX sul tasso di replicazione e di efficienza. L&#39;esperimento descritto qui utilizza solo un singolo canale di flusso. Questo può essere cambiato facilmente con la creazione di multi-canale camere di flusso o con PDMS o simili dispositivi microfluidici. Aumentare il numero di canali facilita notevolmente lo screening delle concentrazioni di proteine, mutanti, o molecole inibitori ed aumenta la rapidità della raccolta di replica dei dati. Come detto, noi dobbiamo fare la E. coli esperimenti replica a 37 ° C con una casa costruita flusso riscaldatore cellula in alluminio, un elemento riscaldante resistivo (riscaldatore a cartuccia) e alimentatore variabile. Questo dà una buona stabilità della temperatura ed evita l&#39;acquisto di un riscaldatore obiettivo. Per calibrare il riscaldamento, abbiamo semplicemente praticato un foro al centro di un top quarzo cella di flusso, una termocoppia inserita nel canale di flusso e di buffer scorreva normalmente. Misurare la temperatura della cella di flusso del buffer a tensioni sempre più accurata permette di riscaldamento.

Replica T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutammato di potassio, 10 mM cloruro di magnesio, 100 mg / ml BSA, con mM ditiotreitolo 5, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Arancione aggiunto immediatamente prima uso. Proteine ​​aggiunto: 5 nM gp4 (esamero), 40 nM polimerasi (1:1 GP5: tioredoxina), 360 nm gp2.5 1,5. Replica E. coli: 50 HEPES mM pH 7,9, 12 mM acetato di magnesio, 80 mM di cloruro di potassio, 100 mg / ml BSA con mM ditiotreitolo 10, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs microM e 15 nM SYTOX Arancione aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso. Proteine ​​aggiunto come: 30 nM DnaB (esamero), 180 nM DnaC (monomero), 30 αεθ nM, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ o τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimero), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramero), 20 nM Pria, 40 nM PriB, 320 nM PRIC, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Descriviamo un semplice microscopio a fluorescenza basato in tempo reale metodo per osservare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Una circolare, modello di DNA biforcuta è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e replicato ampiamente dopo l&#39;introduzione di proteine ​​e nucleotidi replica (Figura 1). La crescita dei prodotti a doppio filamento di DNA (dsDNA) è esteso a flusso laminare e visualizzati utilizzando un colorante intercalante. Misurare la posizione della fine del DNA in crescita in tempo reale permette la precisa determinazione del tasso di replicazione (Figura 2). Inoltre, la lunghezza dei prodotti di DNA completato rapporti sulla processività della replicazione. Questo esperimento può essere eseguita molto facilmente e rapidamente e richiede solo un microscopio a fluorescenza con una macchina fotografica abbastanza sensibile.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  Harvard Medical School. Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Ricerca

Biologia

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...