Name: an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model
Uploaded: 2009-07-13T21:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare per ZEBET al BfR (Germania), BASF SE (Germania), IIVS Inc. (USA), Zet-LSL (Austria) per la partecipazione in studio multicentrico di validazione internazionale della EpiDerm Modified SIT (5 ).

I. condizionamento del tessuto - Giorno 0 <ol><li> Una volta ricevuta la EPI-200-SIT kit EpiDerm, controllare tutti i componenti del kit per l&#39;integrità (per i dettagli vedi tabella kit di reagenti e attrezzature specifiche). </li><li> Per ogni tre tessuti EpiDerm, preparare uno sterile 6 pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. </li><li> In condizioni sterili, aprire il sacchetto di plastica contenente il 24 pozzetti contenenti i tessuti EpiDerm e rimuovere la garza sterile. </li><li> Usa pinza sterile per rimuovere ogni inserto contenente il tessuto EpiDerm e posto l&#39;inserto nel vuoto a 24 pozzetti. Durante questa fase, rimuovere qualsiasi residuo di spedizione agarosio che aderisce ai lati esterni della inserto assorbente da dolci su carta da filtro sterile. </li><li> Entro i prossimi 5 minuti, ispezionare visivamente i tessuti. Non utilizzare tessuti difettosi o tessuti che sono completamente coperti di liquido. </li><li> Utilizzando un tampone sterile punta del cotone, accuratamente asciugare la superficie dei tessuti. Cerca di non toccare il tessuto direttamente - effetti capillari sono sufficienti per eliminare l&#39;umidità dalla superficie del tessuto. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione la superficie del tessuto, il trasferimento di tre tessuti alla riga superiore del 6-pozzetti pre-riempite con 0,9 ml di terreno di coltura. Fuoriuscire eventuali bolle d&#39;aria intrappolate sotto gli inserti. </li><li> Luogo il 6-pozzetti contenenti gli inserti in incubatore per 60 ± 5 minuti di pre-incubazione a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% RH (umidità relativa). </li><li> Alla fine del ± 60 5 minuti pre-periodo di incubazione, trasferire gli inserti dai pozzetti superiori nei pozzi inferiore del 6 pozzetti. Posizionare le piastre di nuovo nel incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per una notte di pre-incubazione (18 ± 3 ore). </li><li> Mettere il resto del terreno di coltura in frigorifero (5 ± 3 ° C). Dopo la notte di pre-incubazione, sostanze chimiche in esame può essere applicata ai tessuti EpiDerm. Nota: La procedura di pre-incubazione può essere abbreviato in caso di consegna tardiva dei tessuti (ad esempio se i tessuti arriva il Mercoledì, invece di Martedì). </li></ol> II. Esposizione chimica - Giorno 1 <ol><li> Preparare un 6 pozzetti per composto chimico in esame, compilando la riga superiore solo con 0,9 ml per pozzetto di terreno di coltura. </li><li> Circa 5 minuti prima della prevista esposizione a sostanze chimiche, rimuovere il 6-pozzetti contenenti la pre-condizione tessuti dal termostato. </li><li> Valutare la superficie dei tessuti e rimuovere l&#39;umidità con punte di cotone sterile. </li><li> Etichettare tutti i 6 e coperchi piastra con i codici del materiale di prova o di nomi. </li><li> Dose i tessuti con i prodotti chimici prova a intervalli di 1 minuto per facilitare il risciacquo delle sostanze chimiche di prova dopo l&#39;esposizione. Mantenere le piastre con i tessuti dosato nel cappuccio sterile, fino a quando il tessuto ultima è dosato. </li><li> Per testare sostanze chimiche liquide, dispensare 30 microlitri della soluzione direttamente in cima al tessuto e posizionare la rete di nylon sulla superficie dei tessuti. Se necessario, delicatamente posizione la maglia con il bulbo di vetro a capo pipetta Pasteur. Non premere sulla superficie del tessuto. </li><li> Per semisolidi prova, utilizzare una pipetta spostamento positivo per erogare 30 microlitri direttamente sopra il tessuto. Se necessario diffondere la chimica con pipetta Pasteur per coprire la superficie del tessuto il più possibile. </li><li> Per i materiali solidi, poco prima applicazione della sostanza in esame, inumidire la superficie del tessuto con 25 ml di DPBS sterile. Ciò permetterà di migliorare il contatto della superficie del tessuto con la sostanza chimica di prova. Riempire un cucchiaio 25 mg calibrato applicazione vivi (o qualsiasi altro strumento appropriato) con circa 25 mg di materiale finemente prova a terra. Applicare la chimica solida prova sulla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare una lampadina a capo pipetta Pasteur di svuotare completamente il cucchiaio. Agitare delicatamente gli inserti di migliorare la diffusione del solido sulla superficie. </li><li> Per le sostanze test con consistenza cerosa, cercare di formare un &quot;cookie come&quot; piatto pezzo di circa 8 mm di diametro e metterlo in cima al tessuto, che è stato precedentemente bagnato con DPBS sterile. Per migliorare il contatto tra la sostanza di prova e dei tessuti, appesantire il &quot;cookie&quot; con un acciaio inossidabile o di un aiuto di plastica. </li><li> Applicare DPBS come il controllo negativo e il 5% SDS come controllo positivo ai tessuti di controllo. </li><li> Dopo la somministrazione del tessuto scorso, il trasferimento di tutti i piatti per 35 ± 1 minuti alla umidificata incubatore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). </li><li> Dopo il 35 ± 1 minuti di incubazione a 37 ° C togliere tutti i piatti dal termostato. Posizionare le piastre all&#39;interno della cappa sterile e attendere un periodo di 60 minuti di esposizione chimica è completata per il tessuto prima dosato. </li><li> Successivamente avviare la procedura di lavaggio utilizzando il un inserto per intervallo di tempo minuto (per assicurazionee che il tempo di esposizione totale per ogni inserto è di 60 minuti). </li><li> Utilizzare una bottiglia di lavaggio per lavare i tessuti con DPBS sterile. Riempire il tessuto inserire 15 volte utilizzando un flusso costante di DPBS e svuotarlo (Nota:. Per i tessuti con una maglia di nylon, lavare la superficie del tessuto 5 volte e rimuovere la rete accuratamente con la punta, pinze taglienti In seguito, proseguono con gli altri 10 lavaggi). </li><li> Dopo il 15 risciacquare con la bottiglia di lavaggio, completamente immergere il 3 volte inserto in 150 DPBS ml e agitare per rimuovere il resto del materiale di prova. </li><li> Infine, sciacquare l&#39;inserto tessuto una volta dal di dentro e una volta dall&#39;esterno con DPBS sterile. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di DPBS dal tessuto agitando delicatamente l&#39;inserto, e assorbente che sulla carta assorbente sterile. </li><li> Trasferire gli inserti di tessuto cancellati per la nuova piastra a 6 e in precedenza pre-riempite con terreno di coltura. Tutti questi passaggi (14-18) deve essere effettuata entro 1 minuto per ogni inserto. </li><li> Dopo l&#39;ultima tessuto è risciacquato accuratamente asciugare la superficie di ogni tessuto con un tampone di cotone sterile con punta. </li><li> Incubare i tessuti nell&#39;incubatrice per i prossimi 24 ± 2 ore (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% di UR). Nota: Ogni tecnico saggio non dovrebbe testare più di 6 sostanze in esame inclusi i controlli negativi e positivi in una corsa di prova singola (set), per poter seguire il protocollo come descritto di seguito </li></ol> III. Mezzo di scambio - Giorno 2 <ol><li> Dopo il 24 ± 2 ore post-incubazione, trasferire gli inserti nella parte inferiore del 6 pozzetti, pre-riempita con 0,9 ml di media. Media da file superiori possono essere raccolti per l&#39;analisi degli endpoint addizionale (citochine, chemochine, ecc.) Analisi degli endpoint secondario è facoltativo. </li><li> Continuare con la post-incubazione (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) per un altro 18 ± 3 ore. </li></ol> IV. MTT Assay Fattibilità - Giorno 3 <ol><li> Etichettare due piastre da 24 pozzetti con i nomi chimici o codici. Una piastra servirà per l&#39;incubazione del tessuto con MTT e l&#39;altra per la fase di estrazione. </li><li> Preparare la soluzione MTT da scongelamento il concentrato MTT (5 mg / ml) e diluire con il diluente MTT. Concentrazione finale della soluzione MTT è di 1 mg / ml. </li><li> Pipettare 300 ml di soluzione MTT in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti. </li><li> Rimuovere il 6-pozzetti da incubatore, asciugare la parte inferiore degli inserti su una carta assorbente, e trasferirli in 24 pozzetti pre-riempite con MTT. </li><li> Posizionare il 24 pozzetti in incubatrice (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% di CO 2, 95% UR) e incubare per 3 ore ± 5 min. Rispettare rigorosamente le 3 ore ± 5 minuti il ​​tempo di incubazione per evitare di scostamento tra MTT letture diverse. </li><li> Quando l&#39;incubazione MTT è completo, utilizzare una pompa di aspirazione per aspirare delicatamente il medium MTT da tutti i pozzi. </li><li> Riempire i pozzetti con DPBS ed aspirare di nuovo. Ripetere questa lavaggio due volte di più e fare in modo che i tessuti sono a secco dopo l&#39;aspirazione ultima. </li><li> Dopo il trasferimento lava gli inserti di un nuovo 24-pozzetti. Immergere gli inserti pipettando gentilmente 2 ml di soluzione estraente (isopropanolo) in ogni inserto. Il livello si alzerà sopra il bordo superiore dell&#39;inserto, così completamente sommergere i tessuti. </li><li> Sigillare il 24 pozzetti (per esempio con Parafilm o con borsa di tenuta) per inibire l&#39;evaporazione estraente. Estrarre il MTT dai tessuti per almeno 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente su un agitatore (~ 120 rpm). Estrazione durante la notte senza agitazione può anche essere usato. </li><li> Dopo il periodo di estrazione è completa, perforare gli inserti con un ago da iniezione o bulbo perline pipetta Pasteur e consentire l&#39;estratto a correre nel pozzo da cui ha tratto l&#39;inserto. </li><li> Scartare l&#39;inserto forato e pipetta la soluzione nel bene su e giù per tre volte fino a quando non è omogenea. </li><li> Per ogni tessuto, trasferire due aliquote 200 microlitri della soluzione viola formazano in un piatto fondo piatto da 96 pozzetti per microtitolazione. Trasferire i duplicati secondo il disegno piastra fissa dato nel foglio di calcolo che accompagna questo protocollo video. Per spazi vuoti, usare isopropanolo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) degli estratti MTT in uno spettrofotometro piastra a 96 pozzetti utilizzando una lunghezza d&#39;onda di 570 nm (540-580), senza un filtro di riferimento. </li><li> Inserire i risultati nel foglio di calcolo per il calcolo automatico dei risultati (Figura 1). </li><li> Una sostanza in esame è etichettato &#39;irritante&#39; (R38 o categoria GHS 2) la vitalità del tessuto percentuale determinata mediante test MTT è &lt;50% rispetto al controllo negativo. Nota: MTT è tossico, quindi assicuratevi di indossare guanti protettivi quando si maneggia. Proteggere MTT e il suo modolutions dalla luce, dal momento che MTT è sensibile alla luce. Usare la soluzione MTT poche ore dopo la preparazione perché si degrada nel tempo. </li></ol> Qualità saggio V. Controlli <ul><li> EpiDerm EPI-200-SIT kit Criteri di accettazione: Modelli in vitro RHE dovrebbero fornire dati coerenti, di alta qualità nel tempo, non solo durante il processo di convalida (8). Linee guida consigliate per assicurare a lungo termine la riproducibilità del test e le prestazioni sono &quot;caratterizzazione completa di cellule o tessuti, il campionamento di ciascun lotto ... per le prestazioni e l&#39;uso regolare dei controlli e prodotti chimici di riferimento per fornire garanzia di costanza di rendimento saggio&quot; (9) . Oltre a criteri di accettazione del test descritta di seguito, ogni lotto di produzione di EpiDerm è il controllo di qualità testati dal produttore nei confronti di un prodotto chimico di riferimento aggiuntivo (1% Triton X-100). Il tempo di esposizione necessario per ridurre la vitalità del tessuto al 50% (ET-50) per il Triton X-100 è determinata. Per EpiDerm, media annua ET-50 i valori hanno spaziato da 5,9 ore a 7,5 ore. Il lotto di CV molto per tessuti di controllo negativo (cioè la variabilità della redditività di base) è stato in media sotto il 7,5% per ogni anno dal 1996. Il ET50 valore di ogni lotto di produzione deve rientrare nel 2 deviazioni standard rispetto alla media storica Triton X-100 ET50 fondata nel 1996 (cioè ET-50 = 6.7 ore, limite inferiore = 4.8h accettazione; limite di accettazione superiore = 8.7h), al fine per essere rilasciato per l&#39;utilizzo da parte del fabbricante. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 1: controllo negativo: L&#39;OD assoluto del controllo negativo (NC), tessuti (trattati con DPBS sterili) nel MTT-test è un indicatore della vitalità del tessuto ottenuto in laboratorio di test dopo la spedizione e l&#39;archiviazione delle procedure e in particolari condizioni di utilizzo. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la media OD 570 di tessuti NC è ≥ 1,0 e ≤ 2,5. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 2: controllo positivo Una soluzione al 5% SDS (in H 2 O) è usato come controllo positivo (PC) e testato in concomitanza con le sostanze chimiche di prova. Significa Concurrent che il PC deve essere testato in ogni test, ma non più di un PC di test è richiesto per giorno. Vitalità del controllo positivo dovrebbe essere entro l&#39;intervallo di confidenza al 95% dei dati storici. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la vitalità dei tessuti PC media espressa come% del tessuto di controllo negativo è del 20%. </li><li> EPI-200-SIT Assay accettazione Criterio 3: Deviazione Standard (SD) L&#39;irritazione cutanea è previsto dalla vitalità medio determinato il 3 singoli tessuti e quindi la variabilità delle repliche di tessuto devono essere accettabilmente basso. Il saggio soddisfa il criterio di accettazione, se la SD calcolato Viabilità singoli tessuti% dei 3 identicamente trattati replica è &lt;18%. </li></ul> Rappresentante Risultati <div style="border:1px #000000 solid; width:100%; padding-bottom:5px;"><img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1.jpg" alt="Figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_2.jpg" alt="Figura 2" /> <img src="/files/ftp_upload/1366/1366fig1_3.jpg" alt="Figura 3" /> </div> Figura 1 I risultati ottenuti per 6 articoli di prova, CN e controllo da PC -. Parte del foglio di calcolo automatico per il calcolo dei risultati. Test di prodotti chimici che hanno ridotto la vitalità del tessuto al di sotto del 50% riferito a NC sono classificate come irritanti. Il test è ottimizzato per fornire risultati che sono sufficientemente lontano dalla classificazione cut-off (50% vitalità), aumentando così la robustezza del test. <div style="background-image:url(../index_RES_1me8j21/c1vzp1s1_strip23px.png); background-position:0 100%; background-repeat:repeat-x; height:24px; width:100%;"><div style="padding-left:26px; padding-right:4px; padding-top:4px; width:100%;"> Materiale </div></div><img src="/files/ftp_upload/1366/materialstable.jpg" alt="Elencare le materie" />

<ol>
	<li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I. n. g. r. i. d., Traue, D., Slawik, B., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests.">Optimization of the EpiDerm Test Protocol for the upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests.</a> ALTEX. 21, 107-114 (2004).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol+-+Assessment+of+the+performance+of+the+optimized+test.">EpiDerm Skin Irritation Test Protocol - Assessment of the performance of the optimized test.</a> ATLA. 33, 351-367 (2005).</li><li>Kand&#225;rov&#225;, H., Hayden, P., Klausner, M., Kubilus, J., Kearney, P., Sheasgreen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Skin+Irritation+Test:+Improving+the+Sensitivity+of+the+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+Protocol.Accepted+for+publication.">In Vitro Skin Irritation Test: Improving the Sensitivity of the EpiDerm Skin Irritation Test Protocol.Accepted for publication.</a> ATLA. , (2009).</li><li>Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovi, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ECVAM+International+Validation+Study+on+In+Vitro+Tests+for+Acute+Skin+Irritation:+Report+on+the+Validity+of+the+EPISKIN+and+EpiDerm+Assays+and+on+the+Skin+Integrity+Function+Test.">The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test.</a> ATLA. 35, 559-601 (2007).</li><li>Liebsch, M., Gamer, A., Curren, R., Frank, J., Genschow, E., Tharmann, J., Remmele, M., Bauer, B., Raabe, H., Barnes, N., Hilberer, A., Wilt, N., Lornejad-Sch&#228;fer, M. R., Sch&#228;fer, C., Spiller, E., Hayden, P., Kand&#225;rov&#225;, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follow-up+validation+of+the+modified+EpiDerm+Skin+Irritation+Test+(SIT):+results+of+a+multicentre+study+of+twenty+reference+test+substances.">Follow-up validation of the modified EpiDerm Skin Irritation Test (SIT): results of a multicentre study of twenty reference test substances.</a> , (2008).</li><li>United Nations. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (GHS). , (2007).</li><li>ESAC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statement on the Scientific Validity of In-Vitro Tests for Skin Irritation Testing. , (2008).</li><li>Gupta, K., Rispin, A., Stitzel, K., Coecke, S., Harbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Issues+and+answers.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Issues and answers.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 43, 219-224 (2005).</li><li>Rispin, A., Stitzel, K., Harbell, J., Klausner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ensuring+quality+of+in+vitro+alternative+test+methods:+Current+practice.">Ensuring quality of in vitro alternative test methods: Current practice.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 45, 97-103 (2006).</li></ol>

The authors are employees of MatTek corporation which produce reagents and tools used in this article.

In questo video, abbiamo dimostrato il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per i test di irritazione cutanea in vitro di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Quando si esegue questo metodo, è importante lavorare in condizioni asettiche e di seguire rigorosamente il protocollo validato, in quanto deviazione dal protocollo possono causare risultati diversi. Alcune modifiche del test sono possibili, tuttavia, le modifiche al protocollo dovrebbero essere discusse direttamente con gli autori. L&#39;unica limitazione di questo metodo è una possibile interferenza della sostanza in esame con l&#39;endpoint MTT. Una sostanza colorata o quella che riduce direttamente MTT (e mima quindi deidrogenasi dei mitocondri cellulari) possono interferire con l&#39;endpoint MTT. Tuttavia, queste sostanza in esame sono un problema solo se al momento del test MTT (ossia 42 ore dopo l&#39;esposizione della sostanza in esame), una quantità sufficiente di sostanza in esame sono ancora presenti sul (o nel) tessuti. Nel caso di questa eventualità, il (vero) riduzione MTT metabolica e il contributo di un materiale di prova o di colore (false) riduzione MTT diretto da parte del materiale in esame può essere quantificata mediante una procedura descritta in dettaglio nella procedura standard di funzionamento del test forniti da MatTek Corp.

an in vitro skin irritation test (sit) using the epiderm reconstructed human epidermal (rhe) model

Il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) è stato sviluppato<sup&gt; (1,2,3)</sup&gt; E convalidato<sup&gt; (4,5)</sup&gt; Per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici. Il SIT EpiDerm utilizza il 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Ricostruito epidermico umano (RHE) EpiDerm modello. La procedura descritta in questo protocollo permette di discriminazione tra gli irritanti di categoria GHS 2 e non irritanti<sup&gt; (6)</sup&gt;. Il test viene eseguito nel corso di un periodo di tempo 4 giorni, composto di pre-incubazione, 60 minuti di esposizione, 42 ore di post-incubazione e vitalità saggio MTT. Dopo aver ricevuto i tessuti e pernottamento pre-incubazione (giorno 0), i tessuti hanno argomenti esposti a sostanze chimiche in esame (giorno 1), che può essere liquido, semi-solidi, solidi o cera. Tre i tessuti sono utilizzati per ogni sostanza chimica di prova, così come per il controllo positivo (5% aq. Soluzione SDS), e un controllo negativo (DPBS). L&#39;esposizione chimica dura 60 minuti, 35 minuti di cui sono conservati i tessuti in un incubatore a 37 ° C. Le sostanze in esame vengono poi rimossi dalla superficie del tessuto da una procedura di lavaggio estesa. Gli inserti di tessuto sono cancellati e trasferiti a mezzo fresco. Dopo un periodo di 24 ore di incubazione (Giorno 2), il mezzo è scambiata. Il mezzo può essere salvate per ulteriori analisi delle citochine o di altri endpoint di interesse. Dopo lo scambio di media, i tessuti vengono incubate per altre 18 ore. Al termine della 42h intero post-incubazione (giorno 3), i tessuti vengono trasferiti in soluzione MTT giallo e incubate per 3 ore. La risultante viola-blu sale formazan, formato principalmente attraverso il metabolismo mitocondriale, viene estratto per 2 ore con isopropanolo. La densità ottica del formazan estratto è determinato utilizzando uno spettrofotometro. Una sostanza chimica è classificato come un irritante la vitalità del tessuto rispetto al controllo negativo tessuti trattati è ridotta sotto il 50%. Questa procedura può essere utilizzata come sostituzione completa dei test di irritazione cutanea coniglio vivo per la identificazione dei pericoli e di etichettatura dei prodotti chimici in linea con le normative UE<sup&gt; (7)</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model at JoVE.com

An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

In questo video, dimostriamo il test di irritazione cutanea EpiDerm (EpiDerm SIT) sviluppato e validato per<em&gt; In vitro</em&gt; Test di irritazione cutanea di sostanze chimiche, tra cui ingredienti cosmetici e farmaceutici.

Un In Vitro</emPelle> Test di Irritazione (SIT) con l&#39;epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

The EpiDerm Skin Irritation test (EpiDerm SIT) was developed (1,2,3) and validated (4,5) for in vitro skin irritation testing of chemicals, including ...

an-vitro-skin-irritation-test-sit-using-epiderm-reconstructed-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

An In Vitro Skin Irritation Test (SIT) using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal (RHE) Model

67.7K Views.  MatTek Corporation.  日本語 

Video: An In Vitro Skin Irritation Test SIT using the EpiDerm Reconstructed Human Epidermal RHE Model

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic wound treatments are inadequate, while available pre-clinical models poorly predict the clinical efficacy of new therapies. Here we describe a high throughput, pre-clinical model to assess multiple aspects of the human skin repair response. Partial thickness wounds were created in human ex vivo skin and cultured across a healing time course. Skin wound biopsies were collected in fixative for the whole-mount staining procedure. Fixed samples were blocked and incubated in primary antibody, with detection achieved via fluorescently conjugated secondary antibody. Wounds were counterstained and imaged via confocal microscopy before calculating percentage wound closure (re-epithelialization) in each biopsy. Applying this protocol, we reveal that 2 mm excisional wounds created in healthy donor skin are fully re-epithelialized by day 4-5 post-wounding. On the contrary, closure rates of diabetic skin wounds are significantly reduced, accompanied by perturbed barrier reformation. Combining human skin wounding with a novel whole-mount staining approach allows a rapid and reproducible method to quantify ex vivo wound repair. Collectively, this protocol provides a valuable human platform to evaluate the effectiveness of potential wound therapies, transforming pre-clinical testing and validation.

Here we demonstrate an optimized technique for assessing wound repair using ex vivo human skin combined with a whole-mount staining approach. This methodology provides a pre-clinical platform for the evaluation of potential wound therapies.

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

Biologia dello sviluppo

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelli 3D efficienti della pelle per applicazioni di ricerca flessibili

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Migliorare la diversità dei modelli di pelle con modelli cellulari 3D convenienti

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Un In Vitro Test di Irritazione (SIT) con l'epidermide umana ricostituita epidermica (RHE) Modello

Trascrizione

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

Migliorare 2D e 3D della pelle

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Generazione di un modello skin-on-a-chip tridimensionale semplificato in una piattaforma microfluidica microlavorazione

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)

Costruzione di modelli di pelle per numerose applicazioni, dalla monocoltura bidimensionale (2D) alla multicoltura tridimensionale (3D)