מחקר זה בוחן אומיקס של תרבית מיקרוביאלית, תוך שימוש בפלטפורמה אוטומטית, כדי לשפר את הבידוד, הגידול וההקרנה החד-שבטית. המטרה היא לשפר את ההבנה של המעיים האנושיים, המיקרוביום והיישומים שלהם. טכנולוגים המקדמים את מחקר המיקרוביום כוללים טיפת מיקרופלואידיקה, פלטפורמות בידוד וסינון אוטומטיות, אלגוריתמים של למידת מכונה ומתקנים חד-שבטיים לאומיקס תרבית מתח גבוה וניתוח מיקרוביום.
מערכת התאים האמצעית משפרת משמעותית את המיקרו-ראייה, הבידוד החד-שבטי והצביעה, ויוצרת כמעט כפול של שיבוטים בהשוואה לשיטות מסורתיות, ובכך מקדמת את יכולת המחקר בתמהיל תרביות מיקרו-מבט במעיים. פרוטוקול זה עונה על הצורך בפלטפורמת סינון מיקרוביאלית בעלות נמוכה עם תמיכה גבוהה, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות ביעילות ויכולת ניקוד עבור מחקר תמהיל תרביות. המעבדה שלנו תתמקד עוד בשילוב של טכניקות נוספות למניפולציה של טיפות, כגון פיצול טיפות ומיזוג כדי להרחיב את היקף היישומים הטכנולוגיים.
כדי להתחיל, פתח את דלת תא הייצור והטיפוח של תא ה-MISS. הסר אנכית את כיסוי המגן עבור השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות. בעזרת מזרק חד פעמי, הוסף 10 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים למכשיר האדים בתוך התא והתקן מחדש את מכסה המגן.
פתח את האריזה הסטרילית של השבב המיקרו-נוזלי ליצירת המיקרו-צינורות והטיפות, והנח אותו אנכית ישירות מעל תא הטיפוח. לאחר מכן בממשק התוכנה, לחץ על התקנה. כאשר חלון האישור המוקפץ מופיע, לחץ על כן כדי להתחיל בהתקנה.
הוצא את מסיר בועות האוויר וקבע אותו הפוך על מיקום מסיר בועות האוויר בתא. חבר את צינור יציאת הטיפות של מסיר בועות האוויר ל-clampשסתום שמתחתיו. הנח אותו דרך כל המוביל לתא איתור ואיסוף הטיפות.
לאחר פתיחת דלת החדר, הכנס אנכית את צינור הזיהוי לשקע הזיהוי. ודא שצינור הזיהוי מוכנס במלואו. הדק את הבורג המאבטח את צינור הזיהוי בכיוון השעון.
לאחר אישור ההחדרה והאבטחה המלאה, סגור את דלת החדר. חבר כל אחד מ -10 צינורות הסיליקון מהשבב המיקרופלואידי, המסומן L1 עד L10, לשסתומי המהדק הממוספרים המתאימים להם. לאחר מכן, חבר את המחבר המהיר מהשבב המיקרופלואידי ליציאה המתאימה במערכת האומיקס, בעקבות חיבורים מתאימים.
לאחר השלמת התקנת השבב, מופיע חלון מוקפץ עם ההודעה, שסתום הידוק צינורות טיפות נפתח. לחץ על אישור כאשר התקנת השבב ליצירת צינורות מיקרו וטיפות תושלם. לאחר שווידאתם שכל הצינורות מחוברים כהלכה לשסתומי המהדק המתאימים להם, לחץ על אישור.
לפני ביצוע האתחול, לחץ על ממשק ההגדרה כדי להגדיר את הפרמטרים הרלוונטיים, כמו מצב סלקטיבי, טמפרטורת הדגירה, זמן הדגירה, מהירות התסיסה, אורך גל זיהוי OD ואורך גל עירור ופליטה לזיהוי פלואורסצנטי. נווט לממשק הבית ולחץ על אתחול. חלון האישור המוקפץ מופיע לחץ על כן כדי לאפשר למערכת ה-IC לבצע בדיקה עצמית של רכיביה, כולל משאבת ההזרקה, הגדרות הטמפרטורה, בדיקת פריקת נוזלי פסולת, מודול סינון ומודול זיהוי טיפות.
לאחר השלמת האתחול, לחץ על אישור מהחלון המוקפץ. כדי להכין את הדגימה, קח את הדגימה המיקרוביאלית ובצע דילול סדרתי עם המדיום המתאים כדי להשיג ריכוז של כ-50 תאים למיליליטר כדי לקבל תרחיף דגימה של 40 מיליליטר. לאחר מכן הברג את המכסה של בקבוק הדגימה ושפך את תרחיף הצואה המדולל לתוך הבקבוק בעזרת מוט ערבוב מגנטי, עד למצב הוספת הדגימה.
הברג את המכסה והדק אותו היטב. לאחר מכן הכנס את המחבר המהיר A למחבר המהיר B כדי להשלים את תהליך טעינת הדגימה. לאחר הנחת בקבוק הדגימה למצב המיועד, הפרד את המחברים המהירים A ו-B מבקבוק הדגימה.
חבר את המחבר המהיר A של בקבוק הדגימה ליציאת O3 במערכת האומיץ'. חבר את מחבר C3 בשבב המיקרופלואידי למחבר מהיר B, וסגור את דלת החדר. בממשק הבית של התוכנה, בחר את המספר הרצוי של צינורות טיפות שייווצרו ולחץ על תוצרת כדי להתחיל ביצירת טיפות תא בודד.
המתן לחלון המוקפץ המציין את השלמת יצירת ה- droplet ולחץ על אישור. סגור את clamp על שלושת המחברים והסר את בקבוק הדגימה. בממשק הבית של התוכנה, בחר את אותו מספר צינורות טיפות המשמש במהלך יצירת טיפות.
תרבות קליקים. אשר את זמן הטיפוח והטמפרטורה, והתחל בתהליך. המתן לחלון המוקפץ, המציין את השלמת גידול הטיפות.
לחץ על כפתור ה-UV במערכת האומיק כדי להדליק אור אולטרה סגול. הקרין את תא זיהוי הטיפות והאיסוף למשך 30 דקות לפני כיבויו. בספסל נקי במיוחד, פתחו את כל 96 צלחות הבאר המשמשות לאיסוף טיפות, וערמו אותן זו על גבי זו ללא מכסים, ומספור אותן ברצף מלמטה למעלה.
ודא כי צלחת הבאר העליונה מכוסה במכסה. פתח את הדלת של תא זיהוי ואיסוף הטיפות, והנח את לוחות הבאר במיקומים המיועדים לכך. הסר את המכסה מצלחת הבאר העליונה ולאחר מכן סגור את דלת החדר.
הפעל שוב את נורית ה-UV במערכת האומיק למשך 30 דקות כדי לבצע עיקור משני. לאחר מכן, הסר את מסיר בועות האוויר ממצב המיקום שלו. הברג את המכסה והסר את הבורג בצורת פרפר מהכובע.
יוצקים 200 מיליליטר שמן להסרת בועות אוויר למסיר בועות האוויר. אבטח את המכסה בחוזקה, ולאחר מכן קבע את מסיר בועות האוויר הפוך במיקומו המיועד. בממשק הבית, בחר את צינור הטיפות למיון.
לחץ על מיון. הזן את מספר לוחות הבאר שיש לאסוף והתחל בתהליך המיון. שים לב לאזור תצוגת התהליך למדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית של טיפות או ערכי פלואורסצנטיות.
נתח כ-20 עד 30 טיפות כדי לבדוק את ערך ה-OD. אם לרוב הטיפות יש OD של כ-0.2, הגדר את סף ה-OD התחתון ל-0.5 ואת סף ה-OD העליון לארבע. המערכת תאסוף אוטומטית טיפות בטווח זה לתוך 96 לוחות הבארות.
המתן לחלון המוקפץ המציין את השלמת המיון והאיסוף של droplet ולאחר מכן לחץ על אישור. פתח את דלת תא זיהוי ואיסוף הטיפות. מניחים את מכסה צלחת הבאר על צלחת הבאר העליונה, ומסירים את הצלחות יחד.
לחץ על ייצוא נתונים כדי לשמור את נתוני אות הטיפות שנאספו. לחץ על מפת חום. בחר את קובץ הנתונים של איסוף הטיפות וצפה ב-OD המוצג בפורמט המיקרו-לוח.
דמיין את ערכי ה-OD הללו כמפת חום שבה עוצמת הצבע תואמת את התפלגות ה-OD על פני הבארות, ומספק ייצוג ברור ואינטואיטיבי. מגוון המינים של מיקרוביוטת המעיים האנושית שהתקבלה מהמערכת האומית, שיטת הצלחת המוצקה ודגימת הצואה הראשונית הושוו ברמת המשפחה. 34 משפחות מיקרוביאליות הועשרו הן בשיטת הלוח המוצק והן בשיטת האומיקס המודגמת, כאשר המערכת האומית העשירה בנוסף ארבע משפחות.
המערכת האומית גם העשירה ביעילות חלק ממשפחות השפע הנמוך. ברמת הסוג, שתי השיטות העשירו 74 סוגים מיקרוביאליים, בעוד ששיטת התאים MISS העשירה בנוסף 13 סוגים. יתר על כן, שני סוגים שהיו בתחילה בשפע נמוך הועשרו ביעילות, באמצעות מערכת OMIC.
תוצאות אלו הראו כי שיטת תרבית התאים MISS סיפקה תנאי גידול טובים יותר לאותם זנים שהיו נוכחים בפרופורציות נמוכות או שהיו בעלי ביצועי גדילה גרועים בתרחיף המיקרוביאלי המקורי.
