מחקר הדוקטורט שלי מתמקד בחקר חלבונים שמופרשים על ידי חיידקים. אני רוצה במיוחד להבין אם חלק מהחלבונים המופרשים האלה חשובים לגרימת זיהומים בבני אדם. אתגר מרכזי בעבודה עם חיידקים קליניים שבודדו לאחרונה הוא עמידותם לאנטיביוטיקה, המעכבת טכניקות גנטיות מולקולריות המסתמכות על ברירה אנטיביוטית, כגון מחיקת גנים והשלמה גנטית.
פרוטוקול שיבוט זה מהיר וחסכוני יותר מכיוון ש-IVA מבטל את הצורך באנזימים מיוחדים ותגובות אנזימטיות עוקבות להרכבת פלסמיד לפני טרנספורמציה של E.coli. כדי להתחיל, הפעל תוכנה מיוחדת לניתוח DNA במערכת מחשב. הרכיבו באופן מלאכותי את הפלסמיד הרצוי.
לאחר מכן תכנן פריימרים הנקשרים לכל מקטע DNA. שלב DNA מבודד באמצעות ערכות מסחריות עם פריימרים המכילים DNA הומולוגי בצינור PCR. לאחר מכן הגבירו את ה-DNA עם ריצת PCR.
לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש להוציא פיפטה של שני מיקרוליטרים. שלב אותו עם טעינת צבע. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז על ג'ל אגרוז 1% כדי להפריד שברי DNA.
לאחר מכן השתמש בתאורת טרנס אולטרה סגולה או LED כדי לדמיין את השברים. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של DpnI ישירות לצינור התגובה של PCR כדי להסיר DNA תבנית מתילית. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות או למשך הלילה.
עם ערכת טיהור חומצות גרעין הסר שאריות אנזימים, מלחים, דימרים פריימר ומוצרי DNA במשקל מולקולרי נמוך. כמת את ריכוז ה-DNA של השברים המטוהרים באמצעות פוטומטריית ספקטרו. השג DNA פלסמיד מוגבר טהור.
חשב את כמות הפלסמיד והכנס DNA הנדרשת לכל תגובת הרכבה in vivo. כעת, שלב את הנפחים המחושבים של הפלסמיד והכנס DNA לצינור מיקרו צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. הניחו את הצינור על קרח.
לאחר מכן, פיפטה 25 עד 100 מיקרוליטר של Escherichia coli מופשר מבחינה כימית לתוך צינור. העבירו את תערובת ה-DNA לתוך ה-aliquot. כדי לבצע טרנספורמציה של הלם חום, תחילה דגרו את התערובת של E.coli ו-DNA על קרח למשך 30 דקות.
מעבירים את הצינור לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה. לאחר מכן מעבירים אותו בחזרה על קרח למשך שתי דקות. העבר באופן אספטי מדיה LB לצינור כדי להרכיב את הנפח למיליליטר אחד.
העבירו את תערובת המיליליטר לצינור תרבית זכוכית. לאחר מכן הנח אותו בחממה רועדת לצורך התאוששות וייצור של סמן בחירת האנטיביוטיקה המקודד בפלסמיד. לאחר ההתאוששות, הפקידו כ-100 עד 1,000 מיקרוליטר של תגובת הטרנספורמציה על אמצעי בחירה מוצקים.
השתמש במפזר תאים סטרילי כדי לפזר את האליקוט על פני צלחת תרבית המקדחה. צנטריפוגה את התאים הנותרים שעברו טרנספורמציה ב -13, 000 גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של מדיה סטרילית.
הפקידו את התאים התלויים מחדש על אמצעי בחירה מוצקים כפי שהודגם קודם לכן. ואז הפוך את לוחות התרבות. מניחים אותם בחממה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
הסר מהחממה צלחות תרבית המכילות תרביות E.coli שעברו טרנספורמציה. ספור את המושבות ישירות כדי לספור. העבירו אמצעי גידול סטריליים בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה לצינורות תרבית סטריליים.
בעזרת לולאת העברה סטרילית, הרם מושבה וחסן את התאים למצע התרבית. דגרו את צינורות התרבות בחממה רועדת. למחרת, בודד DNA פלסמיד מתרביות החיידקים באמצעות ערכת בידוד פלסמיד זמינה מסחרית.
כדי לקבוע אם הפלסמידים מורכבים כהלכה, השתמש בפוטומטריית ספקטרו כדי לכמת את ריכוז ה-DNA. פיפטה הוציאה 50 עד 150 ננוגרם של DNA פלסמיד לתגובת עיכול הגבלה אבחנתית. הוסף אנזימי הגבלה שנבחרו על סמך אתרי המחשוף הצפויים שלהם ב-DNA של הפלסמיד.
לאחר השלמת תגובת ההגבלה, הוסף צבע טעינה לצינור. העמיסו את כל התערובת על ג'ל אגרוז 1%, ובצעו ריצה אלקטרופורטית. לאחר הריצה, דמיין את שברי ה-DNA עם תאורת טרנס UV או LED להשוואה מול האחרון.
עיכול אנזימטי של שני שיבוטי פלסמיד מבודדים הביא לתוצר DNA יחיד של 2.3 זוגות קילו-בסיס עבור שיבוט פלסמיד 1, מה שמצביע על כך שמדובר ב-PSU 19 בלבד. מחשוף יחיד של שיבוט פלסמיד 2 הביא לתוצר DNA יחיד של שלושה קילו-בסיסים, ושני תוצרי DNA של זוגות של 2.3 קילו-בסיס וזוגות של 770 קילו-בסיס לאחר מחשוף כפול.
