מחקר ארוך טווח מתמקד במציאת טיפולים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות בתסמונת דאון. וההתמקדות הנוכחית שלנו היא בנוירוגנזה לקויה של תסמונת דאון, גורם עיקרי למוגבלות שכלית. מצאנו שנוירוגנזה לקויה של תסמונת דאון נגרמת על ידי פגם במחזור התא הדו-פאזי, בניגוד לאמונה הרווחת שזה נובע רק מהזדקנות של תאי אב עצביים של תסמונת דאון.
זיהוי פגם במחזור התא הדו-פאזי באמצעות פרוטוקול מבוסס IPSC אנושי המתואר בכתב יד זה יניע אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות התפתחותיות בהתחשב הן במצב מחזור התא המופחת בשלב מוקדם, והן באי יציאה ממחזור התא בשלב מאוחר. כדי להתחיל, הוסף 10 מיקרומולר של מעכב סלע למדיה שלמה של iPCS אנושי, DPBS, תמיסת ניתוק תאים ומדיום מותנה מזין בתוספת 25 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי. מחממים את כל הריאגנטים ל -37 מעלות צלזיוס.
קח צלחת של שש בארות של iPSCs על מזינים. פיפטו החוצה את המושבות המובחנות, והוסיפו מדיום iPSC אנושי שלם וטרי. מניחים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך שעתיים.
לאחר הדגירה יש לשטוף את הבארות פעם אחת עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים לכל באר. מניחים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך 12 עד 14 דקות.
התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך. אם רוב התאים מתנתקים, אך אם חלקם נשארים דבוקים, הקש בעדינות על הצלחת מהצדדים. הוסף שלושה מיליליטר DPBS בתוספת סידן ומגנזיום לכל באר כדי לדלל את תמיסת ניתוק התאים.
עם פיפטה של חמישה מיליליטר, בצע פיפטינג עדין פעמיים עד שלוש כדי לשבור גושים, תוך הימנעות מבועות. העבירו את התאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר לצנטריפוגה של 50 מיליליטר 2. צנטריפוגה את המתלה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-200 גרם.השתמש במערכת שאיבת ואקום כדי לשאוב את המדיה בעדינות.
כעת, השעו מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום iPSC אנושי. מעבירים את כל התאים בתרחיף על צלחת בגודל 15 ס"מ המצופה בג'לטין 0.1%, ודוגרים בחממת פחמן דו חמצני. אוספים את המדיה עם תאים לצנטריפוגה 2.
צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ב-200 גרם.לאחר מכן שאפו את המדיה בעדינות עם מערכת שאיבת הוואקום. השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום מותנה במזין, בתוספת 25 ננוגרם למיליליטר של BFGF, ו-10 מיקרומולר של מעכב סלע. לאחר ספירת התאים, הכינו תרחיף של 30,000 עד 50,000 תאים למיליליטר.
זרעו את המתלה לצלחת באר. לאחר יומיים, החלף את המדיום המותנה במזין בתא אב עצבי, או מדיום NPC. החלף מדיה בימים השני וה-18 כפי שניתן.
ביום 28, החלף את המדיום בצלחת במדיום NPC בתוספת 10 מיקרומולר של מעכב סלע. לאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממת פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר הדגירה יש לשאוב את הסופרנטנט ולשטוף את הבארות פעם אחת עם DPBS ללא סידן ומגנזיום.
הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים לכל באר. לאחר מכן התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4. לאחר מכן, פיפטה שלושה מיליליטר של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום לכל באר בצלחת.
בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, פיפטה בעדינות את המתלה ושבר את כל הגושים. מסננים את מתלה התא דרך מסננת של 40 מיקרומטר המונחת מעל צנטריפוגה של 50 מיליליטר 2. צנטריפוגה, ולשאוף כפי שהודגם קודם לכן, ואז להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום התמיינות מוגדר בתוספת B 27 עם ויטמין A.Count תאים חיים באמצעות טריפן כחול והמוציטומטר.
לאחר מכן זרע 50,000 תאים לכל באר של צלחת 48 בארות מצופה מטריצה מוסמכת. ביום 33, החלף את המדיום בבארות התרבות במדיום התמיינות עצבית. ירידה משמעותית בתאי עצב חיוביים ל-TUBB3 נצפתה בתרביות תסמונת דאון, בהשוואה לתאים אופלואידים איזוגניים, עם ירידה בערך פי שניים ניכרת ביום 85.
שיעור נמוך משמעותית של תאים חיוביים ל-KI67 נצפה בתרביות תסמונת דאון בשלב הנוירוגני המוקדם, בהשוואה לתאים אופלואידים איזוגניים, והראו ירידה של פי ארבעה בערך. בשלב הנוירוגני המאוחר, רוב התאים האופלואידים האיזוגניים יצאו ממחזור התא עם צביעה מינימלית של KI67, בעוד שרוב תאי תסמונת דאון נותרו חיוביים ל-KI67, והראו עלייה פי חמישה. זוג שני של תסמונת סזון ו-iPSCs אנושיים אופלואידים איזוגניים אישרו רמות מופחתות של נוירונים חיוביים ל-TUBB3 ועלייה בתאי אב עצביים חיוביים ל-PAX6 בתרביות תסמונת דאון בסוף ההתמיינות העצבית, עם ירידה כפולה בתאי עצב חיוביים ל-TUBB3, ועלייה של יותר מפי שניים בתאים חיוביים ל-PAX6.
