תרבית ראשונית קלה וניתנת לשחזור בצפיפות נמוכה באמצעות מלאי קפוא של נוירונים עובריים בהיפוקמפוס

המלאי הקפוא של תאי עצב עובריים של חולדות מוכן לשימוש, ואין צורך בטכניקות מתקדמות לגידול התאים. טכניקה זו קלה מאוד ואין צורך באישור כלשהו לניסויים בבעלי חיים, סידור בעלי חיים בהריון מתוזמנים או ניתוח עוברים. תאי העצב יכולים להיות מתורבתים בכלי תרבית אחרים ולהיות מיושמים עבור סוגים אחרים של ניסויים.

לדוגמה, לוחות מערך מיקרואלקטרודות לניסויים אלקטרופיזיולוגיים. התחל על ידי ציפוי microplate 96-well עם 100 מיקרוליטר של poly-L-ליזין לכל באר. לאחר מכן, לדגור את הצלחות במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להסיר את הפתרון poly-L-lysine. שטפו את הצלחות פעמיים במים מעוקרים ופעם אחת במדיום תרבית טרי ללא תוספים. הניחו את הצלחות לייבוש.

ניתן לעטוף ולאחסן צלחות יבשות עד חודש בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בזריעת תאים, הוסיפו 50 מיקרוליטר של מדיום התרבית לכל באר בצלחות המצופות. ממלאים את הבארות ההיקפיות ב -200 מיקרוליטר מים מעוקרים ודגרים על הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

הסר את בקבוקון הקריו של נוירון ממיכל החנקן הנוזלי והכנס אותו לבלוק חום של 37 מעלות צלזיוס כדי להפשיר חלקית את תכולתו. בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד עם קצה בור רחב, מעבירים באיטיות את תכולת הבקבוקונים לצינור סטרילי, 50 מיליליטר. שטפו את בקבוקון הקריו הריק במיליליטר אחד של מדיום תרבית בטמפרטורת החדר.

העבירו את תמיסת השטיפה לצינור 50 מיליליטר המכיל את תרחיף התא. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של תרבית טמפרטורת החדר בינוני טיפה לתוך צינור 50 מיליליטר, מה שהופך את נפח ל 11 מיליליטר. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר, להעביר את השעיית התא לתוך מאגר.

כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית עם קצוות משעממים רחבים, מחלקים את מתלה התא עם ספירה סופית של 1.0 כפול 10 לארבעת התאים לכל באר לתוך צלחת 96 בארות מצופה. לדגור על תאי העצב למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, להחליף את מדיום התרבית עם 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שחומם מראש לדגור שוב באותם תנאים.

לאחר ארבעה ימים במבחנה, להוסיף ציטוזין בטא-D-arabinofuranoside בריכוז הסופי של 0.2 micromolar לכל באר כדי להפחית את הצמיחה של תאי גלייה. מחזירים את הצלחת לאינקובטור. לאחר 21 ימים במבחנה, לטפל בתאים עם תרופות של עניין.

כדי לשמור על שליטה חיובית, לטפל בתאים עם 100 גלוטמט micromolar לכל באר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני קיבוע. לפני ביצוע מחקרים אימונוציטוכימיים, לתקן את התאים במשך 20 דקות על ידי החלפת פתרון התרבית עם 100 מיקרוליטר של paraformaldehyde בכל באר. לאחר הקיבוע, לשטוף את הבארות פעמיים עם 250 מיקרוליטר של מלוחים חוצץ פוספט לכל באר במשך חמש דקות כל אחד.

במחקר הנוכחי, תאי העצב התפתחו באופן נורמלי מבלי להחליף את מדיום התרבית במשך שלושה שבועות. אימונוהיסטוכימיה גילתה קוצים דנדריטיים חיוביים לדברין לאורך הדנדריטים החיוביים ל-MAP2. נצפתה הפחתה תלוית מינון של צפיפות אשכול דרברין כנגד גירוי גלוטמט.

השתלת השעיית התא לפני שהוא מתחמם מדי חשובה מאוד. התוספת הטיפתית של מדיום התרבית חיונית גם כדי למנוע שינוי פתאומי באוסמולריות.