הפרוטוקול מאפשר לחוקרים למדוד בו זמנית את תגובת הסידן בתאי T ראשוניים יחד עם הערכת תת-הקבוצה שלהם ופנוטיפ פני השטח שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מונעת את הצורך לבודד תת-קבוצות ספציפיות של תאים לפני בחינת תגובות הסידן שלהם. כדי להתחיל, להכין מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר תמיסת מלאי של Indo-1 AM על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של DMSO לתוך בקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. לדלל את תמיסת המלאי לנפח מתאים של cRPMI וריכוז של שישה מיקרוגרם למיליליטר.
מניחים את המדיום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השתמש בתווך זה כדי לדלל תרחיף תאים שהוכן בעבר ביחס של אחד לאחד כדי לקבל חמישה עד 6 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, לצלחת תרבית רקמה של 12 בארות, הוסף מיליליטר אחד של תרחיף תאים לכל באר לכל תנאי ניסוי.
הכינו דגימת בקרה אחת מוכתמת עבור Indo-1 נטול סידן על ידי הוספת EGTA לתאים עמוסי צבע Indo-1. הכינו באר להדברה ביולוגית שלילית ללא פלואורופורים או צבע הודו-1. הכינו בקרה חיובית של Indo-1 על ידי הוספת יונומיצין בריכוז של 50 מיקרומול לתרחיף התא העמוס בצבע בציטומטר הזרימה.
כמו כן, הכינו באר לבקרות כתמים בודדים עבור אוכלוסיות תאים נוספות באמצעות פלואורופורים מצומדים של נוגדנים. לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוגרם של נוגדן חוסם קולטן FC למיליון תאים ודגרו על הצלחת במשך 45 דקות עם הקשה כל 15 דקות כדי להשעות מחדש את התאים. לאחר הדגירה, מערבבים ומסירים את כל נפח התאים מהצלחת ומוסיפים אותו לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מיליליטר.
צנטריפוגה ודקנט הסופרנטנט. לאחר שהתאים נשטפים במיליליטר אחד של cRPMI שחומם מראש, גלולה שוב ומרוקנת את הסופרנטנט. להשהות מחדש את התאים במיליליטר אחד של cRPMI ולדגור על כל צינור, משאיר את החלק העליון של הצינור פתוח מעט לחילופי גזים, המאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של אסטרי AM תוך תאיים.
לאחר מכן, הכינו תערובת אב של כל הנוגדנים המצומדים פלואורוכרום המוגדרים על-ידי המשתמש והוסיפו אותו לתאי המנוחה עבור מיליליטר אחד מנפח התא. לאחר מנוחה, גלולה את התאים ולשטוף את הגלולה על ידי resuspending במיליליטר אחד של cRPMI מקורר לארבע מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה והנח את הצינורות על קרח.
יש להשהות דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI נטול פנול אדום באמצעות צינור זרימה פוליסטירן של חמישה מיליליטר עם מכסה. כדי לשמור על הטמפרטורה באמצעות ניתוח שטף סידן, הכינו אמבט חרוזים על ידי הוספת חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן וחממו אותו עד 37 מעלות צלזיוס. חותכים בזהירות צינור כרוניקה של 50 מיליליטר לשניים ומשליכים את החלק העליון של הצינור.
ממלאים שלושה רבעים מהצינור הנותר בחרוזי אמבטיה ומאפשרים לו להגיע ל -37 מעלות צלזיוס באמבט החרוזים. הניחו את אמבט החרוזים ליד ציטומטר זרימה, יחד עם מתלה קלקר כדי למקם את הצינור. לפני הניתוח על ציטומטר זרימה, לחמם את הצינורות בנפרד ל 37 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות.
היכנס לתוכנת ציטומטר הזרימה ולחץ על הכרטיסייה ספריה. לאחר מכן בחר תגי פלורסנט כדי להוסיף Indo-1 הקשור לסידן ו- Indo-1 ללא סידן. לאחר מכן בחר לייזר UV תחת קבוצות תגים פלואורסצנטיים ולחץ על הוסף כדי להוסיף שם תג פלואורסצנטי.
בחר את עירור הלייזר ואת אורך גל הפליטה ולאחר מכן לחץ על שמור. המשך למערך הניסוי. לחץ על הכרטיסייה רכישה, פתח/צור ניסוי חדש והוסף את תגי הפלואורסצנט הרצויים לניסוי.
צור קבוצת התייחסות וקבוצת מדגם חדשה עבור הניסוי ותייג את שתי הקבוצות. תחת הכרטיסייה רכישות, הגדר את האירועים להקליט למקסימום ב -10 מיליון, עצירת נפח לנפח המרבי של 3000 מיקרוליטר, וזמן עצירה למקסימום של 36, 000 שניות. רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור נוגדנים מצומדים המוגדרים על-ידי המשתמש הכלולים בלוח הרב-צבעוני ועבור צבע פונקציונלי מסוג Indo-1.
הוסף 50 מיקרומול של יונומיצין לבקרה ולמערבולת Indo-1 החיובית הקשורה לסידן. הוסף את צינור הזרימה ללוח ההזרקה לדוגמה ולחץ על הקלט. לאחר מכן הוסף בקרת Indo-1 שלילית ללא סידן לציטומטר הזרימה ולחץ על הקלט.
בטל את הערבוב של הפקדים המוכתמים הבודדים על-ידי לחיצה על כפתור בטל מיקס. לאחר השלמת ביטול הערבוב, צור תרשימים רציפים באמצעות גליון העבודה הלא מעורב, כגון SSC-A לעומת FSC-A, להסרת פסולת מהדגימה ו- SSC-A לעומת SSC-H להסרת כפילויות. לאחר מכן צור שערים על ידי לחיצה על Plot.
הוסף תרשים לגליון העבודה ולחץ פעמיים בתוך השער כדי ליצור אוכלוסייה מגודרת במורד הזרם. המשיכו עד לטיפול בכל האוכלוסיות המעניינות. לאחר מכן, חממו את דגימות הבקרה המוכתמות הבודדות שהוכנו בעבר ל -37 מעלות צלזיוס לניתוח רציף.
הגדר את תוכנת ציטומטריית הזרימה והפעל DI במי קרח למשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח את היציבות הנוזלית של ציטומטר הזרימה. הגדר תרשימים רציפים בגליון העבודה הלא מעורב על-ידי יצירת שערים באמצעות לחצני מלבן מצולע או שער אליפסה כדי לכלול את האוכלוסייה המעניינת. לחץ פעמיים בתוך השער ושנה את הפרמטרים y ו- x ציר ל- SSC-A לעומת SSC-H.
השלם את הגדרת פרמטרי הציר על ידי לחיצה שמאלית על הציר. צור תרשים עם SSC-A לעומת אות צבע כדאיות. שער התאים החיים שהם שליליים לצביעת צבע אמין.
תאים חיים שליליים לצביעה חיה מתים יתקבצו בסימן האפס הן על ציר y והן על ציר x. לחץ פעמיים על העלילה הפנימית כדי ליצור חלקה חדשה המכילה רק לימפוציטים חיים של תא אחד. שנה את ציר Y ל- Indo-1 לעומת זמן בציר x להדמיה של זרם הסידן.
לאחר מכן הכניסו את הדגימה הביולוגית המחוממת ל-SIT של המכונה. הפעל את הדגימות בקצב של 2, 500 עד 3000 אירועים בשנייה בקצב זרימה בינוני כדי לדמיין זרימת סידן במספר מוגבל של אוכלוסיות תאים. הוסף את הצינור הבא לאמבט החרוזים בבקרת רכישה.
לחץ על הקלט כדי להקליט את הנתונים הראשוניים במשך 30 שניות כדי לקבל רמה בסיסית של איתות סידן בדגימה. לאחר מכן לחץ על עצור והסר את הצינור מפתח הזרקת הדגימה. הוסף 30 מיקרוגרם של אנטי CD3 לא מצומד ישירות לתוך צינור הדגימה כדי להתחיל זרימת סידן.
החזיר במהירות את הצינור ליציאת הזרקת הדגימה ולחץ על הקלט בתוכנה. הקלט נתונים במשך שבע דקות, תוך צפייה בזמן שחלף תחת בקרות הרכישה בתוכנה. לאחר מכן לחץ על עצור בתוכנה.
הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של יונומיצין ורשום במשך 30 שניות כדי לקבל את אות הסידן המרבי בתאים המעניינים. המשך לדוגמה הבאה וחזור על זרימת העבודה עד שכל הדגימות ייאספו. שמור את הניסוי ולחץ על קובץ ה- zip לייצוא.
קבצים לא מעורבים מועלים לתוכנה חיצונית לניתוח ציטומטריה של זרימה. אות עקבי יציב בתרשים של זמן לעומת פיזור צדדי הצביע על יציבות נוזלית. אוכלוסיית הלימפוציטים הייתה מגודרת ואחריה אפליה של סינגלים על חלקה של גובה פיזור צדדי לעומת שטח.
סינגלים הוערכו כדאיות. לאחר מכן הוחל על אוכלוסייה שלילית CD19. תת-קבוצות תאי T אלה הוערכו באמצעות נוגדנים ל-CD4 ו-CD8 על ידי הדמיה של פלואורסצנטיות Indo-1 הקשורה לסידן לעומת הזמן.
באוכלוסיות תאים בודדות, תרשים האינדו-1 הקשור לסידן לעומת הזמן הראה קו בסיס לפני הגירוי. תגובת שיא כאשר רמות הסידן התוך-תאי ירדו ותגובת הסידן התעוררה על-ידי הוספת יונומיצין. לפני הוספת נוגדנים נגד CD3, זוהה אות Indo-1 חלש הקשור לסידן.
במהלך תגובת השיא, התאים הראו אות Indo-1 חזק הקשור לסידן והפחתת Indo-1 נטול סידן. חמש דקות לאחר השיא, הפלואורסצנטיות של האינדו-1 כמעט חזרה לקו הבסיס. לאחר הוספת יונומיצין, הודגם אות חזק של Indo-1 הקשור לסידן, מה שמצביע על העמסת צבע מספקת של התאים.
ניתוח האוכלוסיות הנדירות בוצע על ידי שרטוט Indo-1 הקשור לסידן לעומת Indo-1 נטול סידן לאחר שבחן כל אוכלוסייה מעוניינת בכך. וניתוח תגובת הסידן לאורך כל מהלך הזמן עבור כל תת-קבוצה. שטף סידן באמצעות פרופיל ספקטרום מלא יכול להוביל לניתוח ציטומטרי של זרימת פרמטרים גבוהה במגוון תת-קבוצות חיסוניות.
ניתן להשתמש באנליזה ממדית גבוהה עבור אשכולות בלתי משוחדים של תת-קבוצות תאי T בשילוב עם ציטומטריה של זרימת פרמטרים גבוהה לניתוח מתקדם. טכניקה זו פותחה לניתוח של תת-קבוצות חיסוניות מרובות בשילוב זו עם זו בדגימה בתפזורת.
