פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת תוך ניתוח מטבולומיקה לא ממוקדת. הטכניקה פשוטה מאוד ונוחה לתפעול וניתן לזהות סוגים נוספים של הפרשות שורש. מה שעוזר לבנות את טביעת האצבע המטבולית של הפרשות שורש הצמח.
התחל את עיקור זרעי medicago sativa או אלפלפה על ידי שטיפת הזרעים עם 0.1% hypochlorite נתרן במשך 10 דקות. לאחר מכן יש לשטוף עם 75% אלכוהול אתילי למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף את הזרעים מעוקרים מספר פעמים עם מים מזוקקים.
ואז להנביט אותם על נייר פילטר לח שהונח בצלחת פטרי סטרילית. ב 30 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר הנביטה, מעבירים 20 זרעים גדולים ושמנמנים מונבטים באופן אחיד לסל גריפה בבקבוק תרבית מלא בתמיסה מזינה.
הניחו את כל בקבוקי התרבית בתא גידול בתנאים מבוקרים. לאחר שבועיים, העבירו 15 שתילי אספסת אחידים לבקבוק זכוכית חדש כדי לחשוף אותם למיליגרם אחד לקילוגרם ו-10 מיליגרם לקילוגרם DEHP לניסוי התרבית. עטפו את בקבוקי הזכוכית לטיפול ולבקרה ברדיד אלומיניום ופרפילם כדי למנוע פוטוליזה ותנודתיות של DEHP.
יש להשלים את התמיסה התזונתית מדי יום כדי לשמור על רמת הנוזלים. הניחו וסובבו את הבקבוקים באופן אקראי כל יומיים כדי להבטיח תנאי גידול עקביים לשתילי האספסת. לאחר שבעה ימי גידול, הוציאו את שתילי האספסת מהבקבוקים.
ולשטוף אותם עם מים טהורים מספר פעמים כדי להכין אותם לאוסף של exudates שורש. התחילו את ניסוי איסוף ההפרשה על ידי העברת 10 שתילי אספסת אחידים לצינורות צנטריפוגות מלאים ב-50 מיליליטר מים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה. כדי לאסוף הפרשות שורשים, שמרו על הצינורות זקופים במשך שש שעות כשהשורשים שקועים במים.
לאחר שתסיים, עטוף את צינורות הצנטריפוגה ברדיד אלומיניום כדי להגן על השורשים מפני אור. מוציאים את הצמחים ומקפיאים לייבש את הנוזל שנאסף לפרופיל מטבוליטים. המשך בניסוי המיצוי על ידי הוספת 1.8 מיליליטר של תמיסת מיצוי לדגימות המיובשות בהקפאה.
במערבולת במשך 30 שניות. לאחר מכן, להחיל את גלי אולטרסאונד על צינורות במשך 10 דקות באמבט מי קרח. לפני צנטריפוגת הדגימות.
בזהירות להעביר 200 מיקרוליטר של supernatant לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. שאפו 45 מיקרוליטר של סופרנאטנט מצינור הצנטריפוגה וערבבו אותו בדגימות בקרת איכות או QC בנפח סופי של 270 מיקרוליטר. לאחר שתסיים, יבש בהקפאה את התמציות ברכז ואקום.
לאחר השלמת הייבוש, מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של ריבונוקלאז סטנדרטי פנימי וממשיכים לייבוש. לאחר אידוי, להוסיף 30 מיקרוליטר של תמיסת הידרוכלוריד methoxyamination ולדגור את הצינורות ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 40 מיקרוליטר של מגיב BSTFA לדגימות לפני הצבת צינורות ב 70 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות עבור derivatization.
לאחר שהדגירה הסתיימה והדגימה המפורקת מגיעה לטמפרטורת החדר, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של אסטרי מתיל חומצת שומן מומסים בכלורופורם לדגימות המפורקות. באמצעות עמוד נימי בגודל 30 מטר על 250 מיקרומטר על 0.25 מיקרומטר, מפרידים מיקרוליטר אחד של השורש מופרש עם הליום גז נשא בקצב זרימה של 1.0 מיליליטר לדקה. כוונו את טמפרטורת ההזרקה ל-280 מעלות צלזיוס.
ולשמור על טמפרטורת קו ההעברה ב 280 מעלות צלזיוס. הגדר את תוכנית התנור להפרדה. לאחר הפרדת התמציות, בצע ספקטרומטריית מסות במצב התנגשות אלקטרונים עם אנרגיה של מינוס 70 אלקטרון וולט.
שמרו על טמפרטורת מקור היונים על 250 מעלות צלזיוס. קבל ספקטרום מסות באמצעות מצב ניטור סריקה מלא עם טווח סריקת מסה של 50 עד 500 מסה על ידי טעינה בקצב של 12.5 ספקטרום לשנייה. 778 פסגות התגלו בכרומטוגרף של דגימת הביקורת.
מתוכם זוהו 314 מטבוליטים על פי ספקטרום המסות. החומצות חולקו גם לחומצות שומן, חומצות אמינו, חומצות אורגניות וחומצות פנוליות. בנוסף, כמה חומרים נפוצים הנמצאים בדרך כלל בהפרשות שורש התגלו גם בהפרשות שורש אספסת כולל פירימידינים, פירמידינים הידרוקסיים, פלבנואידים, פנולים, קטונים, פירימידינים ודיטרפנים.
מפת חום שורטטה בהתבסס על ציון VIP כדי להמחיש את השונות במטבוליטים דיפרנציאליים בין טיפולי DEHP שונים. בהשוואה לדגימות הביקורת, החשיפה ל- DEHP שינתה באופן משמעותי את התוכן של 50 מטבוליטים והפרשת שורש אספסת. כולל בעיקר כמה פחמימות וחומצות אורגניות בעלות משקל מולקולרי נמוך.
ניתוח המסלולים המטבוליים הראה כי DEHP עיכב באופן משמעותי את חילוף החומרים של פחמימות שהן תוצר של פוטוסינתזה, מה שמצביע על כך ש- DEHP יכול לדכא את הפוטוסינתזה של אספסת במידה מסוימת: DEHP נראה כמקדם את חילוף החומרים של חומצות שומן המסייעות להתנגד ללחץ מ- DEHP. לפחות יש לבצע את הפרשת שורש הזרע עבור כל טיפול כדי להבטיח ניתוח נתונים מטבוליים מדויק. אנו יכולים לקבוע מטבוליזם דיפרנציאלי ולהמשיך לחקור את הכללים החשובים בהתנהגות הסביבתית של מזהמים.
את יחסי הגומלין בין צמחים לבין הקהילה הביולוגית הרחבה יותר של השדה ניתן לפענח בעיקר באמצעות שיטה זו.
