פיתחנו את תחליב פיקרינג המייצב ננו-חלקיקים PLGA. תחליב פיקרינג שיפר את הזיקה התאית לתאי חלבון אנטיגן, וגרם להפנמה יעילה של אנטיגנים. אמולסיות פיקרינג המיוצבות על ידי ננו-חלקיקים היו קלות להכנה ולהעברת אנטיגן ביעילות.
בנוסף, נעשה שימוש בשיטה כדי לעקוב אחר הזיקה של תחליב לתא ולפרט על ההפנמה. פרוטוקול זה מספק תובנות לתכנון פורמולציות חדשניות עם יעילות תאים גבוהה והפנמת אנטיגן יעילה, המספקות פלטפורמה לפיתוח חיסונים יעילים. כדי להתחיל, להוסיף 100 מיליגרם של חומצה פולילקטית-קו-גליקולית ל 10 מיליליטר של תערובת אצטון ואתנול ביחס של ארבעה לאחד כדי לשמש כשלב השמן.
מניחים 20 מיליליטר של תמיסה מימית PVA מתחת למכסה האדים ומערבבים מגנטית בקצב של 400 סיבובים לדקה. הוסיפו חמישה מיליליטר של פאזת השמן לתמיסת ה-PVA טיפה אחר טיפה באמצעות משאבת מזרק. לאחר מכן ערבבו את התערובת במכסה האדים עד שהממיסים האורגניים יתאדו לחלוטין.
לאחר נדידה של ממיסים אורגניים, צנטריפוגה את התערובת ב 15, 000 G.Wash שלוש פעמים או יותר עד מי הכביסה הסופי הוא צלול ושקוף. השהה מחדש את חלקיקי ה- PLGA השטופים בשני מיליליטרים של מים שעברו דה-יוניזציה והקפיא את התערובת בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי לאפיין את הגודל ואת פוטנציאל הזטה של ננו-חלקיקי PLGA, הוסף 10 מיקרוליטרים של ננו-חלקיקי PLGA למיליליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה כדי לקבל תמיסה מדוללת ולהעביר את התמיסה המדוללת לתא DTS1070.
הפעל את המחשב ואת מנתח פיזור האור הדינמי. לאחר מכן מקם את תא DTS1070 במערכת DLS. לחץ על תוכנת Zetasizer וצור קובץ מדידה חדש כדי להגדיר את הליך הקביעה.
לאחר מכן התחל את הליך הקביעה כדי להשיג את גודל החלקיקים ואת ההתפלגות הפוטנציאלית של zeta. כדי להכין ננו-חלקיקי PLGA ייצבו תחליב פיקרינג, או PNPE, הוסיפו ננו-חלקיקי PLGA מיובשים בהקפאה למים שעברו דה-יוניזציה בריכוז של ארבעה מיליגרם למיליליטר ולאחר מכן הוסיפו סקוואלן כשלב השמן. הכן PNPE באמצעות סוניקציה של שלב אחד למשך חמש דקות בהספק של 100 וואט בסוניק אמבט מים.
יש לדלל 20 מיקרוליטר של PNPE ומיליליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה. שחרר 20 מיקרוליטר של האמולסיה על השקופית. שימו לב למורפולוגיה ולהומוגניות של האמולסיה באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בהגדלה של פי 40 וקבלו תצלומים.
הפעל את מעיל הסחיטה על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. לחצו על כפתור הבקרה והגדירו את הזמן והמהירות של הציפוי. חבר את צינור החנקן למעיל הספין והתאם את השבר של גליל הגז ל -0.4 קילופסקל.
מניחים את השבב הנקי על היניקה של מעיל הספין. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פולי-ל-ליזין טיפה למרכז חיישן הסיליקון הדו-חמצני וסגרו את המכסה העליון של מעיל הספין. לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל לצפות את הדגימה ולעצור את ההתקן בסיום.
כבה את משאבת הוואקום, כבה את לחצני ההפעלה והבקרה והסר את חיישן הסיליקון הדו-חמצני המותאם poly-l-lysine. כדי לקבוע את ההידבקות של בועיות חוץ-תאיות ביומימטיות ל- PNPE, הפעל את המחשב, את היחידה האלקטרונית ואת המשאבה הפריסטלטית, והפעל את בקרת הטמפרטורה בפינה השמאלית התחתונה בתוכנה כדי להבטיח שהטמפרטורה שנקבעה היא בערך מעלה אחת צלזיוס מתחת לטמפרטורת החדר. הנח את חיישני הסיליקון הדו-חמצני המעובדים פולי-L-ליזין בתא הזרימה בהתאם להוראות ההפעלה וחבר את קו המדידה בין תא הזרימה למשאבת הזרימה.
מקם את תא הזרימה בתוך מערכת מודולי הזרימה. לחץ על סרגל הכלים רכישה ובחר הגדרת מדידה כדי לחפש 1, 3, 5, 7, 9 ו -11 אוקטבות של השבב בערוץ שבו נעשה שימוש. כדי לתקן את קו הבסיס, לחץ על התחל מדידה כדי לאפשר לאוויר להיכנס למודול הזרימה עד שקו הבסיס של האוויר יהיה חלק.
לאחר הזרמת מים שעברו דה-יוניזציה במשך 10 עד 15 דקות כדי לאפשר שוב את שיווי המשקל הבסיסי של התמיסה, יש לשאוב את תמיסת ה-PNPE המוכנה לתוך מודול הזרימה בקצב זרימה של 50 מיקרוליטר לדקה כדי להשיג ספיחת שיווי משקל בחיישן צורן דו-חמצני. לשאוב את תמיסת השלפוחית החוץ-תאית הביומימטית המוכנה לתוך מודול הזרימה בקצב זרימה של 50 מיקרוליטר לדקה כדי לעקוב אחר תהליך הידבקות bEV למשטח PNPE. לדגום את התאים הדנדריטיים של מח העצם עם 1640 מדיה מלאה במשך שבעה ימים ולאחר מכן לזרוע אותם לתוך צלחות לייזר קונפוקליות קטנות ב 1 פעמים 10 עד 6 לכל באר לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.
מערבבים 0.5 מיליליטר של ציאנין 5 שכותרתו ovalbumin, עם 0.5 מיליליטר של PNPE למשך שעה אחת ומסירים את האנטיגן הנוזלי על ידי צנטריפוגה ב 5, 000 גרם למשך 20 דקות לפיתוח נוסחת חיסון. לאחר השעיה מחדש עם 200 מיקרוליטרים של מים שעברו דה-יוניזציה, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של הפורמולה לתוך כלי הלייזר הקונפוקליים הקטנים תחת ספסל נקי במיוחד ותרבית משותפת עם תאים דנדריטיים של מח עצם למשך שש שעות. לאחר הסרת נוזל התרבית מהתאים, שטפו אותם פעמיים עם מלח חצוב פוספט שחומם מראש.
תקן את התאים עם תמיסת פורמלדהיד 4% ו- PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים עם PBS פעמיים או שלוש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחד. חלחלו לתאים עם 100 מיקרוליטרים של תמיסת 0.5% Triton X-100 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר שטיפת התאים שוב עם PBS, מכסים את התאים על צלחת תחתית הזכוכית של צלחות הלייזר הקונפוקליות הקטנות עם 200 מיקרוליטרים של פלואורסצין איזותיוציאנט מצומד תמיסת עבודה של פלואורסצין פלוידין ודגרה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר שטיפת התאים עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, לצבוע מחדש את הגרעינים עם 200 microliters של תמיסת DAPI במשך כ -30 שניות. לניתוח תמונה, הפעל את חומרת המיקרוסקופ הקונפוקלי ברצף הכולל את הלייזר, הקונפוקל, המיקרוסקופ והמחשב.
לחץ על התוכנה ובחר Nikon Confocal כדי להיכנס למערכת הבדיקה. במערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי, הפעל את היחידות השונות בסדר שצוין. ראשית, הגדר את ערוצי FITC, DAPI ו- Cy5 והתאם את ה- HV וההיסט המתאימים.
לאחר מכן לאחר בחירת עדשת השמן 100 פעמים והניחו טיפה של שמן ארז על גבי מניחים את צלחות הלייזר הקונפוקליות הקטנות המכילות תאים דנדריטיים מוכתמים של מח עצם על שלב המיקרוסקופ. לחץ על לחצן הסריקה. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אתר תאים מעניינים על ידי הזזת ציר ה-x, ציר ה-y וציר ה-z.
כוונן את עוצמת הלייזר, גודל התמונה ופרמטרים אחרים כדי לאפשר סריקה של תמונות קונפוקליות באיכות גבוהה. לבסוף, לחץ ללכוד כפתור ושמור את התמונות. ההידבקות של שלפוחיות חוץ-תאיות ביומימטיות ל-PNPE הייתה במעקב באמצעות QCM-D.
ירידה מיידית בתדירות, הצביעה על הידבקות מהירה של שלפוחיות חוץ-תאיות ביומימטיות ל-PNPE לאחר המפגש. יתר על כן, דלתא F ירדה עם עלייה בריכוז הבועיות החוץ-תאיות הביומימטיות, מה שמשקף השפעה תלוית ריכוז. מיקרו-חלקיקים של PLGA וננו-תחליב מיוצב על-ידי חומרים פעילי שטח היו קשורים באופן חלש לשלפוחיות חוץ-תאיות ביומימטיות, אפילו בריכוז גבוה של 80 מיקרוגרם למיליליטר, מה שנבע ככל הנראה מהיעדר אתרי מגע עם תאי מערכת החיסון.
האות הפלואורסצנטי של ציאנין-5 ovalbumin הצביע על כך שהכמות הכוללת של אנטיגן שהופנם לתאים גבוהה משמעותית בקבוצה שטופלה ב-PNPE בהשוואה לזו שבקבוצת המיקרו-חלקיקים PLGA ובקבוצת הננו-אמולסיה המיוצבת על-ידי חומרים פעילי שטח. הניתוח הכמותי של קליטת התאים הראה עוצמה יחסית גבוהה משמעותית של תאים פלואורסצנטיים ותאי דנדריטים של מח עצם שטופלו ב-PNPE מאשר אצל אלה שטופלו במיקרו-חלקיקים של PLGA ובתחליב ננו מיוצב על-ידי חומרים פעילי שטח. התוצאות שהתקבלו הראו כי PNPE קידם את הפנמת האנטיגן והעביר ביעילות את האנטיגן תוך תאי.
על מנת להשיג תחליב הומוגני, התערובת חייבת להיות מזועזעת ברציפות במהלך סוניקציה.
