זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

שיטה זו מציעה דרך להגביר את האות מאירועי קשירה לצורה הניתנת לזיהוי חזותי לשימוש דל במשאבים או שניתן לכמת באמצעות מכשור מבוסס ספיגה. זהו פרוטוקול מהיר יחסית, חד פעמי, כדי לקבוע את נוכחות המטרה של האפתמר במדגם של עניין. ניתן להשוות את התוצאות מול עקומת כיול סטנדרטית אם רוצים לכמת.

אנשים חייבים להיות מדויקים מאוד בעת העברת וערבוב הפתרונות, כמו ערבוב מספיק יוביל לתוצאות שליליות. כמו כן, ודא ריאגנטים ותמיסות נשמרים מקוררים עד לשימוש כדי למזער את אות הרקע. התחל על ידי הפעלת מוצרי מחשוף ריבוזימים על ידי הוספת חמש יחידות של קינאז פולינוקלאוטיד T4 בצינור PCR.

לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של חיץ ריבוזימי 5X מוכן מראש לכל צינור דגימה. כדי להדגים באופן חזותי ספציפיות, הוסף 1.5 מיקרוליטר של שני מילימולרים תאופילין או שני מילימולרי קפאין לכל מבחנה כדגימות הבדיקה וערבב כל דגימה ביסודיות על ידי פיפטינג חמש עד 10 פעמים. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של 600 ננו-מולרי RNA המכיל תחום aptameric ספציפי למטרה לכל צינור דגימה, ולאחר מכן pipetting כדי לערבב את הרכיבים במהירות.

כעת, הניחו את הצינור על בלוק קר כדי למזער את אות הרקע. לאחר הכנת כל צינורות התגובה, דוגרים על כל דגימה בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות בדיוק. בתום הדגירה, החזירו מיד את מבחנות הדגימה לקרח.

הוסיפו 3.5 מיקרוליטר של תערובת אנזימי ניקזה פולימראז לכל צינור דגימה וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסף 31.5 מיקרוליטר של תערובת תגובת EXPAR המכילה נוקלאוטידים של תבנית ומאגר תגובה לכל צינור דגימה וערבב על ידי פיפטינג. לאחר הכנת כל הדגימות, יש לדגור על הדגימה המוכנה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות באמצעות טיימר.

מיד להחזיר את צינורות הדגימה לקרח לאחר הדגירה. הוסף שני מיקרוליטרים של תמיסת hemin לכל צינור דגימה לפיתוח צבע וערבב היטב. לאחר מכן, הוסף 58 מיקרוליטר של פתרון TMB הזמין מסחרית לכל צינור דגימה, לערבב היטב, ולדגור לפיתוח צבע.

קרא את הדגימות באופן איכותי בעין או כמת את התוצאות באמצעות קורא לוחות ספיגה, כמתואר בכתב היד. המבנה הממוטב יכול לזהות רק 500 ננו-מולרית תאופילין תוך 30 דקות. תכשירי דגימה הנחשפים למטרה מייצרים צבע כחול, בעוד דגימות שאינן מכילות מטרה נותרות חסרות צבע.

עקומה סטנדרטית הוכנה מהאות שנמדד ב-A450 לאחר 30 דקות של פיתוח צבע. חשוב לשמור דגימות על קרח כאשר לא מבצעים דגירה, שכן אפילו הרנ"א האופטימלי עדיין יציג רמת פעילות רקע נמוכה.