ניתוח מוניטור כירורגי תוך ניתוחי הוא עדיין אתגר גדול בניתוחי כריתת גידול מכיוון שהוא דורש כלי אבחון כדי לאשר את הכריתה המורכבת של רקמה סרטנית באופן מדויק ומהיר. לאחר מכן ניתן להימנע מניתוחים חוזרים ונשנים בשל שולי ניתוח חיוביים. המיקרוסקופיה האולטרה-סגולה האולטרה-סגולה המהירה שלנו יכולה לספק תמונות היסטולוגיות מסומנות של דגימות רקמה תוך 18 דקות עם שטח הדמיה של חמישה על חמישה ריבועי מילימטר, מה שמראה פוטנציאל גדול לניתוח שוליים כירורגיים תוך ניתוחיים.
מי שידגים את ההליך יהיה שיופנג לי, סטודנט שנה אחרונה לדוקטורט מהמעבדה שלי. התחל בהגדרת התאורה האופטית עבור המערכת המיקרוסקופית על ידי שימוש בלייזר מצב מוצק שאוב דיודות Q עם אורך גל של 266 ננומטר כמקור עירור. התקינו שתי עדשות קמורות כדי להרחיב את קרן הלייזר והניחו חור סיכה קרוב לנקודת המוקד של העדשה הקמורה הראשונה לצורך סינון מרחבי.
השתמש במראה גלוונומטר 1D כדי לשקף את קרן הלייזר כלפי מעלה. בעזרת העדשה האובייקטיבית, מקד את קרן הלייזר בדגימה. תקן את ה- UT הממוקד בצורת טבעת כאשר האזור הפעיל פונה כלפי מעלה לתוך מיכל מים מתוצרת מעבדה עם חלון שקוף אופטית בתחתית המכוסה על ידי כיסוי קוורץ דק, ולאחר מכן חבר את מיכל המים לשלב ידני בן שני צירים של המיקרוסקופ כדי לשלוט במיקום הצדדי של ה- UT. בסיום, הפעילו את לייזר ה-UV והתאימו את מיקום ה-UT כדי לאפשר לקרן הלייזר לעבור דרך מרכז ה-UT, ואז כבו את לייזר ה-UV ומלאו את מיכל המים במים שעברו דה-יוניזציה כדי לטבול את ה-UT במלואו. חבר את הפלט של ה- UT לשני מגברים כדי לקבל רווח כולל של 56 דציבלים ולאחר מכן חבר את הפלט של המגבר השני לכרטיס רכישת נתונים, או DAQ, המותקן במחשב.
לאחר מכן, הצמידו מחזיק דגימה לשלב ידני עם ציר z המחובר לשלבים ממונעים ב-xy ולאחר מכן הצבת ארבע חתיכות של סרט הדבקה דו-צדדי סביב החור הריק של מחזיק הדגימה. מאוחר יותר, המשך ליישר את המערכת על ידי הצמדת סרט שחור לשקופית זכוכית ולאחר מכן הצבת מגלשת הזכוכית כדי לכסות את החור של מחזיק הדגימה כאשר הסרט השחור פונה כלפי מטה. לאחר לחיצה על מגלשת הזכוכית על מחזיק הדגימה, הורידו את מחזיק הדגימה כדי לטבול את מגלשת הזכוכית במים.
נתק את ה-UT והמגברים בצורת טבעת, ולאחר מכן חבר את ה-UT ל-pulser/receiver ואת הפלט של הפולס/מקלט לאוסצילוסקופ. הפעילו את הפולס/מקלט למצב הד הדופק עם משרעת הדופק של שישה והרווח ב-20 דציבלים. לאחר הגדרת הפרמטרים, התאם את מיקום z של מחזיק הדגימה, הגדר את המיקום של מישור המוקד האקוסטי שבו האותות העל-קוליים הם מקסימליים.
שנה את הדופק/מקלט למצב השידור לפני הגדרת הרווח ל-60 דציבלים, ולאחר מכן אפשר את יציאת הלייזר והתאם את מיקום ה-z של העדשה האובייקטיבית כדי למקסם את אותות הפוטואקוסטיקה או ה-PA הנמדדים על-ידי האוסצילוסקופ. כדי להפוך את אות ה- PA שנוצר לסימטרי ומקסימום, התאם את המיקום הצדדי של ה- UT בצורת טבעת, ולאחר מכן התאם את מיקום z של מחזיק הדגימה כדי למקסם את אותות ה- PA. חזור על ההתאמות עבור מיקום z של העדשה האובייקטיבית ומחזיק הדגימה כדי לייעל את הסימטריה והמשרעת של אותות ה- PA.
כאשר אותות ה- PA ממוטבים, רשום את עיכוב הזמן או את הזמן שלוקח לגלי הרשות להגיע ל- UT באוסצילוסקופ. הזז את מחזיק הדגימה כדי לצלם מיקומים שונים של הסרט השחור. התאם את שטוחות מחזיקי הדגימה כך שלאותות ה- PA הנוצרים מכל מיקום של הסרט השחור תהיה השהיית זמן זהה לזו שנמדדה קודם לכן.
לאחר השלמת יישור המערכת, כבה את הלייזר וחבר את ה- UT לשני המגברים. כדי להכין פרוסת מוח עכבר קבועה בפורמלין ומוטמעת בפרפין, תיקנו את המוח שנקטף בפורמלין בעל מאגר נייטרלי של 10%. לאחר 24 שעות, לעבד את המוח הקבוע על ידי התייבשות עם אלכוהול מדורג, ניקוי עם קסילן והטמעה עם פרפין.
השתמש במיקרוטום כדי להשיג פרוסות בעובי של חמש מיקרומטר של המוח המשובץ. מניחים את פרוסות הדגימה על מגלשות הקוורץ לייבוש בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה. מאוחר יותר, דה-פרפין של חלקי המוח עם חומר ניקוי כדי למנוע אותות רקע גבוהים של פרפין.
כדי להכין פרוסת מוח טרייה של עכבר, שטפו את מוח העכבר שנקטף באמצעות PBS ואז חתכו פרוסה בעובי חמישה מילימטרים של דגימת המוח ביד ולאחר מכן שטפו את פרוסת המוח עם PBS כדי להסיר את הדם על חתך הרוחב. למיקום הדגימה, הכינו מיכל דגימה מתוצרת מעבדה עם קרום פוליאתילן שקוף UV בעובי של 10 מיקרומטר, ואז הוסיפו טיפת מים לממברנה והניחו את הדגימה הביולוגית על מיכל הדגימה כדי לכסות את המים. לאחר מכן, הניחו את המיכל המכיל את הדגימה על בעל הדגימה והבטיחו לכסות את החור הריק של בעל הדגימה.
הגדר את לייזר ה- UV למצב ההדק החיצוני והשתמש בתוכנית תצוגת המעבדה שנבנתה במעבדה כדי להגדיר את פרמטרי הסריקה כמתואר בכתב היד. התחל את סריקת הניסוי על אזור קטן על-ידי הגדרת מספר הצעדים הנעים של מנועי ציר x ו- y, ולאחר מכן התאם את השלב הידני של ציר z כדי למקם את הדגימה במישור המוקד לקבלת אותות PA מרביים. לאחר הזזת מנועי x ו- y-axis לנקודת ההתחלה הרצויה והגדרת אזור הסריקה על ידי הגדרת ערכי xn ו- yn, התחל את תוכנית רכישת התמונה.
כאשר התמונות נדרשות, כבה את הלייזר והסר את מחזיק הדגימה. אחסנו רקמות ביולוגיות טריות בפורמלין בעל מאגר נייטרלי של 10%. השתמש באותות PA שנאספו כדי לשחזר את תמונת הקרנת המשרעת המרבית בעזרת אלגוריתם עיבוד תמונה שנבנה במעבדה.
הניתוח הייצוגי מציג את תמונות ה-UV-PAM וה-H&E של פרוסת מוח של עכבר FFPE. בתמונת UV-PAM המוגדלת, ניתן היה לפתור את גרעיני התאים הבודדים. גרעיני התא המתאימים נמצאו בתמונות המוכתמות הסטנדרטיות של H&E, והראו את הדיוק הגבוה של המערכת הנוכחית להדמיה תאית.
אלגוריתם למידה עמוקה יושם כדי להעביר את תמונת UV-PAM בקנה מידה אפור לתמונה מוכתמת H&E וירטואלית. חשוב להתאים את המיקום של המתמר העל-קולי בצורת טבעת כדי לאפשר לאור ה-UV לעבור דרך מרכז במהלך יישור המערכת. זה מבטיח שניתן יהיה להשיג אות פוטואקוסטי הניתן לזיהוי ולייעל אותו עוד יותר כאשר הלייזר דולק.
ניתן לשלב את אלגוריתם הסיווג שלנו עוד יותר כדי לסווג אזורים סרטניים ונורמליים בתמונות, ולשמש כהדמיה מסייעת וכפלטפורמת אבחון לאנשי מקצוע רפואיים.
