פרוטוקול זה מציע שיטה של העברת ריפוי גנטי לרקמות עיניים מרובות באופן בטוח, קל ויעיל. הוא גם ניתן להתאמה להזרקות אינטרסטרומליות וסוברטינליות בבעלי חיים קטנים. השימוש במסלול התת-קרקעי של ההזרקה הוא זעיר פולשני.
הוא מהווה פחות סיכונים וטומן בחובו הבטחה גדולה לאספקת AV לטיפול במחלות עיניים מרובות. עם למעלה ממיליארד אנשים ברחבי העולם הסובלים מליקוי ראייה, שימוש בשיטה בטוחה וקלה לאספקת תרופות מציע ישימות רחבה לטיפול בגורמים רבים ושונים לעיוורון. שיטות העברת הגנים המתוארות בפרוטוקול זה מעניינות במיוחד את אלה המפתחים אסטרטגיות התערבות פוטנציאליות ומתרגלים רופאי עיניים, שבסופו של דבר יספקו תרופות אלה לחולים.
האתגר הגדול ביותר עבור מי שמבצע פרוטוקול זה בפעם הראשונה הוא ככל הנראה החדרת המחט לחלל הלחמית המושגי. כדי להתחיל, להרכיב את מערכת ההזרקה על ידי הצבת מיקרוסקופ סטריאו ומשאבת מזרק בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, לחתוך את צינורות פוליאתילן לאורך של כ 50 ס"מ.
הכנס את קצה המחט בעלת 36 המדים לקצה אחד של הצינור. לאחר מכן למלא מזרק חד פעמי 3 מיליליטר עם מים סטריליים ולהכניס אותו לתוך הצד של הצינור מול המחט. שטפו את הצינורות שלוש פעמים, לסירוגין בין מים סטריליים ל-70% אלכוהול כדי לחטא את הצינורות ולוודא שאין נזילות, סתימות או נזקים לאורך כל הצינורות.
באמצעות מזרק חד פעמי של 3 מיליליטר, ממלאים את הצינורות במים סטריליים ומשאירים את הצינורות מחוברים למזרק החד פעמי. לאחר מכן מניחים חתיכת parafoam על פני השטח של ארון בטיחות ביו, ולהוסיף בריכה של מים סטריליים אליו. טבלו את חלק הצינורות המחוברים למחט בבריכת המים הסטריליים.
לאחר מכן, משוך את המזרק החד פעמי מפתח הצינור כדי למנוע כניסת אוויר למערכת הצינורות עם הסרת המזרק. ואז למלא מזרק המילטון 10 מיקרוליטר עם מים סטריליים. לאחר מכן, חבר את מחט מזרק המילטון לקצה הפתוח של הצינורות על ידי טבילת קצה המחט של מזרק המילטון לתוך בריכת המים הסטריליים על סרט הפרה.
לחצו לחיצה ממושכת על כפתור ההיפוך המהיר במסך המשאבה כדי להזיז את גושי הדחיפה לאורך המשוער של המזרק. לאחר מכן, פתח את ידיות הידוק של התושבת כדי לשחרר את הסוגריים התומכים על הדוחף ואת בלוקים מחזיק המזרק. לאחר מכן, טען את מזרק המילטון על בלוק מחזיק המזרק ואבטח את המזרק בהתאם להוראות היצרן.
כדי להתאים את הפרמטרים במסך הגדרת המשאבה, לחץ על הלחצן Force"button והגדר את רמת הכוח ב- 30% לאחר מכן קבל את השינויים כדי לחזור למסך ההגדרות. לחץ על לחצן התחלה מהירה", בחר שיטה ולאחר מכן בחר באפשרות החדל בלבד". עבור אפשרות המזרק, בחר המילטון 1700, ולאחר מכן לחץ על זכוכית "ובחר 10 מיקרוליטר.
מאוחר יותר, בחר את קצב העירוי ואת נפח ההזרקה. הוציאו את המים ממזרק המילטון תוך השארת מחט הצינורות וההזרקה מלאים במים על ידי לחיצה על כפתור ההחדרה. לאחר מכן, למשוך את הנגיף על ידי הצבת מחט ההזרקה לתוך aliquot של מלאי הנגיף.
לאחר מכן משוך מעט בחזרה את מזרק המילטון על ידי לחיצה על הכפתור האחורי כדי להציג בועת אוויר קטנה בצינור. לאחר הרדמת החיה, לתפוס את הלחמית עם מלקחיים. לאחר מכן הכנס את המחט לתוך הלחמית עד שהשיקוע מכוסה כולו על ידי קרום הלחמית, והנח את המחט על הגלובוס.
במקביל, התחל את ההזרקה על ידי לחיצה על כפתור התחל באמצעות מתג כף הרגל. כדי לבחון את התפלגות וקטור ה-AAV, העינית והרקמות הסובבות אותה הוכתמו בהמטוקסילין ובאוזין. המקטעים הסגיטליים המייצגים הראו כי פיזור הדיו ההודי התרחש בעיקר בצמוד לשרירים החוץ-עיניים בפני השטח החיצוניים של הסקלרה ברקמות החיבור הרופפות הפריוקולריות.
כדי לאשר התמרה של AAV 8 משלים עצמי בשמונה שבועות לאחר ההזרקה, נבדק שפע חלבון פלואורסצנטי ירוק בחתכים על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה. התוצאות גילו כי וקטורים AAV 8 מתמרים ביעילות את השרירים הפריוקולריים האחוריים לעין ולקרנית. כדי לנתח את ההתפלגות הביולוגית הווקטורית, מספרי העתקי גנום וקטורי ותאי עין מובחנים באיברים אחרים, כולל כבד ולב, נבדקו על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית באמצעות פריימרים וגששים ספציפיים לטרנסגן.
הביטוי של הטרנסגן אושר על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך, מה שהציע כי הזרקה תת-קרקעית של AAV 8 גורמת לביטוי טרנסגני בעפעף, בלחמית, בקרנית ובעצב הראייה. בועת האוויר תשמש כמחסום בין המים בצינור לבין התרופה הטיפולית. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים אחרים לחקור את השימוש במסלול התת-לחמיתי של מתן הן לתמיסות עיניים והן לטיפולים גנטיים בעיניים למחלות מרובות.
