מחלת הנטינגטון, HD, היא פתולוגיה חשוכת מרפא, ניווניות הנגרמת על ידי מוטציה בחלבון ציד קידוד גנים. הצייד מזוהה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות, וכנראה מעורב בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול. כדי לחקור את ההשפעה של ציד מוטציות על הדינמיות של microtubules, השתמשנו בהדמיה vivo של חלבון EB3, אשר מווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כיפוף וייצוב הקצוות ההולכים וגדלים.
כדי לטעון EB3 עם תווית פלואורסצנטית לפיברובלסטים של העור האנושי, החלנו תעתיק פלסמיד. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית כדי להשיג מהביופסיה של העור של חולה EB3 למחקר זה. לספק את הביופסיה למעבדה בתוך כמה שעות בינוני DMEM, בתוספת 15 מיקרוגרם למיליליטר של פניצילין, ו 50 יחידות למיליליטר של סטרפטומיצין.
מניחים רקמת ביופסיה בצלחת פטרי של שישה ס"מ, יחד עם כמות קטנה של בינוני. באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את דגימת הביופסיה לחתיכות על 0.5 עד אחד מילימטרים בגודל. מניחים אחד, שניים, משיגים שברים לצלחת פטרי באורך 3.5 ס"מ, ומניחים כיסוי סטרילי מעל חתיכות הביופסיה.
לאט להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיום צמיחה. סיבים תרבותיים במדיום הצמיחה באינקובטור CO2, ב-5% CO2 שהוא שבעה סנטיגרד, 80% לחות. לאחר ארבעה, שבעה ימים, תחילה קרטינוציטים, ואז פיברובלסטים מתחילים לנדוד מהרקמה לתחתית המנה.
טיפוח תאים. להדמיה טרנספקטי, יש להשתמש במנות צלחת קונפוקליות מזכוכית, יש להשתמש במנות קונפוקליות. מכסים את החלק התחתון של המנה בתמיסת ג'לטין אוטומטית של 0.1%, המוכנה במים מזוקקים.
דגירה במשך 15 דקות. הכן את המדיום התרבותי. מערבבים היטב, מאחסנים גבוה פלוס 4 סנטיגרד.
מחממים את המדיום לפלוס 37 מעלות צלזיוס, לפני שמוסיפים לתאים. להעריך את התרבות מתחת למיקרוסקופ. הסר את המדיום, ולשטוף את התאים עם DPBS סטרילי.
הוסף מיליליטר אחד של פתרון טריפסין 0.25% מחומם מראש לתאים. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ אם הם מתנתקים לחלוטין מהמצע. בטל טריפסין עם מיליליטר אחד של מדיום התרבות.
העבר את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 200 G במשך חמש דקות. הסר את supernatant, resuspend לוח התא במיליליטר אחד של המדיום התרבותי.
תספור את מספר התא. חשב את מספר התאים הנדרש. דה-זרע אותם עם צפיפות של שמונה עד 15, מוכפל על ידי 10 לכוח של שלושה, עבר על ידי סנטימטר.
זה מחולק למיליליטרים של המדיום התרבותי. הסר את פתרון הג'לטין מצלחת התרבות מוכנה לחיסון, ומיד להוסיף שני מיליליטר של השעיית התא. לטפח פיברובלסטים בנוסף 37 סנטיגרד בחממה CO2.
רענן את המדיום כל יומיים, ארבעה ימים. לניסויים, השתמש בתאים של ארבעה, 11 מעברים. עד ההדבקה, המפגש צריך להיות לא יותר מ 70, 80%להחליף את המדיום התרבותי עם אחד טרי 24 שעות לפני transfection.
הכן קומפלקס DNA-שומנים, המבוסס על האזור והצפיפות של זריעת התא. סוכן טרנספקטיון ליפוזומלי, ואת הצפיפות של זריעת התא של אחד, מוכפל על ידי 10 לכוח של ארבעה תאים, עבר על ידי סנטימטר שימש. הוסף שלושה מיקרוליטרים של ריאגנט מסחרי ל-125 מיקרוליטרים של Opti-MEM, ללא אנטיביוטיקה.
מבלי לגעת בקירות הצינור, יש לגעת בעדינות. לדלל DNA plasmid, GFP-EB3, הוספת מיקרוגרם אחד של DNA plasmid ל 125 microliters של OptiMEM. בעדינות resuspend.
הוסף DNA פלסמי מדולל לכל שפופרת של ריאגנט טרנס-זיהום מדולל, יחס אחד לאחד. דגירה במשך 30 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA לצלחת פטרי שישה סנטימטרים עם תאים.
מערבבים עם נדנדה צליבה במשך 30 שניות. דגירה תאים עם סוכן transfection במשך 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את המדיום לרענן אחד. לנתח את היעילות לאחר בדיקה ב 24 ו 48 שעות.
מתכונן להדמיה. לפני הדמיה חיה של תאים, לשנות את המדיום התרבותי למדיום ללא צבע מחוון PH כדי להפחית את autofluorescence. יש למרוח בזהירות שמן מינרלי על שלב התא הבינוני כדי לכסות לחלוטין את המדיום, ולבודד אותו מהסביבה החיצונית כדי להפחית את חדירת ה- O2 ואת האידוי הבינוני.
השתמש במנורת מאקרו ובכל התמונה בעדשה אובייקטיבית של פי 60, פי 100 עם צמצם ספרות גבוה כדי לצלם תמונה. עבור תצפיות ויוה, המיקרוסקופ חייב להיות מצויד באינקובטור כדי לשמור על התנאים הדרושים לתאים, כולל פגיעה בשולחן האופטי, ואת העדשה לעבור 37 Centigrade, תא סגור היה אספקת CO2, ותמיכה ברמת הלחות. מניחים את צלחת הקונפוקלי עם התאים במחזיק המיקרוסקופ לפני ההדמיה.
ודא כי המנה והמצלמה מחוברים באופן מאובטח למחזיק כדי למנוע נסחף בעת צילום תמונות. הגדרת פרמטרי ההדמיה. בחר את ערכי החשיפה הנמוכים, מאחר שהשקופית גורם לפגיעה בתאים, מגיבה עם מרחבי חמצן.
כדי לחקור את הדינמיקה של מיקרוטובולות בפיברובלסטים של העור האנושי, בחרנו חשיפה של 300 אלפיות השנייה. תתמקד במושא העניין. עבור הדמיה ארוכת שנים, זמן-לשגות, מערכת ייצוב המיקוד האוטומטית, מערכת מיקוד מושלמת היא הכרחית, שכן ייתכן שיש שינוי לאורך הציר להגדיר, ואת מושא העניין יהיה אפוא מחוץ לפוקוס.
בחר את תנאי ההדמיה האופטימליים, בהתאם לחשיות של התא ולקצב דועך הכרום התלקחי. מאז microtubules הם מבנים דינמיים מאוד, הם זמן קצר למדי בתורו ניתן לבחור, ואת קצב הפריימים חייב להיות גבוה מספיק. כדי לחקור את הדינמיקה של המיקרוטובולים בפיברובלסטים של העור, השתמשנו בתדר של מסגרת אחת לשנייה, במשך שלוש, חמש דקות.
בעת בחירת האובייקט הבא כדי לקבל תמונה, התרחק מהאזור שכבר התמונה, שכן תחת השפעת האור, יש דימום תמונה חולף. מכיוון שהשתמשנו בתדר הדמיה גבוה יחסית, התריס לא נסגר בין תמונות, והמנורה איחרה לכל תקופת ההדמיה, אשר דועכת גדלה. בחר את הסרטונים האופטימליים לחקר הדינמיקה של המיקרוטובול באופן חזותי, תוך התחשבות באיכות ההדבקה, באיכות התמונות של המיקרוטובולות, יחס אות לרעש אופטימלי והיעדר נסחף של תאים מנותחים.
השתמש בסרטונים שנבחרו כדי ללמוד את הדינמיקה של המיקרוטובולות בתוספת הקצוות, על-ידי מסבך אותם בתוכנית פיג'י. הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא טרנספקטציה, המבטיחה ביטוי חלבון מספיק. יחס אות לרעש טוב, ללא צילומים של מיקרוטובולות והיעדר נסחף תאים הם קריטיים להדמיה.
הדמיה של דינמיקת המיקרו-קוטביות מספקת מידע חיוני על תכונות הצייד המוטנטי. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מיושם על מחקרים של מחלות אחרות, אשר הפתולוגיה שלהן מסבכת תכונות דינמיות של ציטוסקלטון.
