ייזום אפופטוזיס מתווך על ידי הפעלה של כספיות בפלטפורמות מולקולריות של סמן. אנו מציגים את הזיהוי של דיסק מורכב המוות של תאי החניכה, המשמש כפלטפורמה להפעלת caspase-8. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי של ההרכבה ואת הרכב של מתחם הדיסק יחד עם מתן מידע על עיבוד caspase-8 במתחם זה.
התחל את הניסוי עם תאים שהם 80% עד 90% משוחחים ודבקים במנה. יש להשליך את המדיום ולהוסיף מדיום טרי לתאים החסידים. לאחר מכן לעורר את התאים עם הריכוז הנבחר של CD95L על ידי החזקת הצלחת בזווית וצינורות ליגנד לתוך המדיום מבלי לגעת בתאים החסידים.
כדי לקצור את התאים, מניחים את צלחת התא על קרח. הוסף 10 מיליליטר של PBS קר להשעיית התא ולגרד את התאים המצורפים מהצלחת. לאסוף את השעיית התא בצינור 50 מיליליטר.
לשטוף את צלחת התא עם 10 מיליליטר של PBS קר פעמיים ולהוסיף את פתרון לשטוף לתוך אותו צינור 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה השעיית התא ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת supernatant, resuspend גלולה התא מיליליטר אחד של PBS קר.
ואז להעביר את השעיית התא לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה השעיית התא ו resuspend גלולה התא במיליליטר אחד של PBS קר שוב. חזור על הצנטריפוגה שוב, ולאחר מכן resuspend את גלולה התא במיליליטר אחד של חוצץ תמוגה ודגרה זה במשך 30 דקות על קרח.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה ליסאט במהירות מקסימלית במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור נקי. להשליך את הכדור ולאסוף 50 דגימת microliter של ליסאט בצינור אחר לקביעת ריכוז החלבון. עבור immunoprecipitation, להוסיף שני microliters של נוגדן נגד APO1 ו 10 microliters של חלבון מוכן חרוזים ספרוז ליסאט.
הוסף 10 מיקרוליטרים של החרוזים לבד לצינור נפרד המכיל את lysate לשמש בקרת חרוזים. לדגור על התערובת המכילה את הליסאט, הנוגדנים וחרוזי החלבון A Sepharose למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. למחרת, צנטריפוגה התערובת ב 500 פעמים G במשך ארבע דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, לשטוף את החרוזים על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS קר להשליך את supernatant לאחר צנטריפוגה. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים. לאחר השלכת שטיפת PBS האחרונה, שאפו את החרוזים רצוי עם מזרק 50 מיקרוליטר המילטון.
כדי לבצע את הכתם המערבי, להוסיף 20 microliters של חוצץ טעינה 4X לחרוזים וחום ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בו זמנית, מחממים את פקדי הלסייט ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. העמיסו את הריסאטים, האימונופרציפיטנטים ותקן החלבון על ג'ל SDS של 12.5% ופעלו במתח קבוע של 80 וולט.
לאחר ריצת הג'ל הושלמה, להעביר את החלבונים מן ג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז. לאחר השלמת ההעברה, מניחים את הממברנה הכתומה בקופסה ודגר אותה במשך שעה בחסימת פתרון תחת תסיסה עדינה, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך חמש דקות עם PBST. כדי לזהות את החלבונים, מוסיפים את הנוגדן הראשוני הראשון בדילול המצוין לממברנה ודגר אותו בן לילה בארבע מעלות צלזיוס בתסיסה עדינה.
למחרת, לשטוף את הממברנה עם שלוש שטיפת PBST חמש דקות, ולאחר מכן לדגור על הממברנה עם 20 מיליליטר של נוגדן משני עם רועד עדין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST שוב. לאחר השלכת שטיפת PBST האחרונה, להוסיף כמיליליטר אחד של מצע peroxidase חזרת לממברנה ולזהות את אות הכימותרפיה.
גירוי של סרטן צוואר הרחם HeLa-CD95 תאים עם CD95L הביא רמה גבוהה של היווצרות CD95 דיסק מנוטר באמצעות IMMUNOPRECIPitation CD95. CD95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ו- c-FLIPS נצפו ב- CD95 immunoprecipitations אלה המצביעים על היווצרות דיסק יעילה. מוצרי המחשוף של p43-FLIP ו- p22-FLIP זוהו ב- immunoprecipitations, המציין הפעלת caspase-8.
תאי HeLa-CD95 המפרסמים יתר על המידה c-FLIP ארוך שימשו לניתוח היווצרות CD95 DISC. בדומה לתאי HeLa-CD95 הורים, לא זוהה גיוס של FADD, פרוקספז-9, פרוקספז-10, חלבוני C-FLIP ו- PARP1 בחלבוני האימונופרציפיטים של תאים אלה ללא טיפול CD95L. תאי T ראשיים מופעלים התאפיינו ברמות גבוהות של CD95, FADD, פרוקספז-8, פרוקספאז-10 ו- c-FLIPS באימונופרנציות נגד CD95.
טכניקה זו מאפשרת ניתוח של היווצרות דיסק מולקולרי, כולל עיבוד של caspase-8 ב- DISC. כל מדרגות הכביסה חשובות מאוד. בנוסף, נקודות גירוי ודגיה יש לקחת ברצינות.
זוהי הדרך היחידה למדוד את ההרכבה במתחם הדיסק. עם זאת, כדי למדוד הפעלת caspase-8, ניתן גם ליישם התקפות פעילות caspase-8. גישה זו אפשרה לנו לקבל תובנות חדשות על חניכת אפופטוזיס.
