היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שהוא פחות עתיר עבודה וגוזל זמן מאשר השיטה המסורתית של ספירת יחידות יוצרות מושבה כדי להעריך את הצמיחה התוך תאית של שחפת Mycobacterium. טכניקה זו מקלה על החוקרים לסנן במהירות תרופות שאושרו על ידי ה-FDA במטרה לייעדן מחדש כטיפולים מכוונים מארח לטיפול בשחפת. השיטה היא מאוד פשוטה ופשוטה.
ידע בסיסי בטכניקות של תרביות תאי T מיקובקטריאליים ונשאים של EO יספיק כדי לעקוב אחר הפרוטוקול צעד אחר צעד. כדי להתחיל, להעביר שישה עד שמונה מיליליטר של תרבית מיקובקטריאלית מוחלשת H37Ra מבקבוק T25 לתוך צינור פוליפרופילן 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגה על ספסל.
לאחר הסרת הצינור בזהירות, העבירו את הצינור לארון הבטיחות הביולוגי והמתינו דקה עד שהחיידקים ישקעו. יש לשפוך את חומר החיטוי לתוך מיכל ההשלכה של חומר החיטוי. לאחר מכן, סכם את הצינור והשעה את החיידקים בתווך הנותר על ידי הקשה עדינה על צד הצינור ומתן אפשרות לחיידקים להתיישב למשך דקה אחת.
מוסיפים ומערבבים שני מיליליטר של RPMI שלם שחומם מראש ומעבירים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. כדי להשעות את mycobacteria, לצייר את ההשעיה במזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 25 מד. לאחר מכן, יש לפלוט בעדינות רבה לאורך הדופן הצדדית של הצינור כדי למזער את ייצור האירוסול, ולחזור על התהליך שש עד שמונה פעמים.
יש להשליך את המחט והמזרק במיכל חדים בארון הבטיחות. מעבירים את המתלים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר וצנטריפוגה כדי להפיל את כל הגושים שנותרו. החזירו את הצינור לארון הבטיחות ותנו לחיידקים להתיישב למשך דקה אחת.
מעבירים את ה-1 עד 1.5 מיליליטר העליונים של הסופר-נטנט לצינור חדש. יש להשליך את הצינור המקורי לדלי הפסולת המכיל את חומר החיטוי. מערבבים היטב ומוסיפים כמויות שונות של מתלה המיקובקטריאלי לשתי מגלשות תא הזכוכית, ומדגרים את המגלשות במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר שצנחו למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לעקור חיידקים שאינם פאגוציטוזה, הסירו את המדיום ממגלשת תא הזכוכית. לשטוף פעם אחת עם שני מיליליטר של PBS. להפשיר את האליקוטים של 4% PFA ב- PBS המאוחסנים במינוס 20 מעלות צלזיוס.
מדללים את האליקוט ל-2% PFA ומוסיפים שני מיליליטר לכל באר. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את המגלשה מארון הבטיחות להכתמה. יש להשליך PFA למיכל הפסולת הכימית PFA ולשטוף את המגלשה מתחת לזרם עדין של מי ברז.
באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק, יש לפזר מספיק אורמין כדי לכסות את התאים במגלשה, ולדגור על המגלשה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. שטפו את עודפי הצבע מהמגלשה במי ברז והוסיפו את הקונצ'ר למשך דקה אחת בחושך. לאחר שטיפת הקונצ'ר העודף, יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם כתם Hoechst בחושך.
ואז לשטוף את כתם Hoechst. ולאחר ניקוז עודפי מים, להוסיף טיפה של antifade וכיסוי להחליק. בחנו את השקופית המיובשת באוויר מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי באמצעות המטרה 100x שמן.
מיקובקטריה תפלואור בירוק תחת מסנן פיץ וגרעינים יפלואורסצ'ה בכחול תחת מסנן DAPI. ספרו את מספר המיקובקטריה פאגוציטוזה לכל תא ואת אחוז התאים הנגועים כדי לקבוע MOI. חשב את נפח התרחיף המיקובקטריאלי הדרוש כדי להשיג את ה- MOI הנדרש בהתבסס על שטח הפנים של באר בצלחת.
לאחר ערבוב תרחיף המיקובקטריה, הוסף את הנפח המחושב לתאים על 12 לוחות באר כדי להשיג את ה- MOI הרצוי. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות כדי לאפשר מיקובקטריה להיות phagocytosed. לאחר מכן להסיר את החיידקים החוץ תאיים על ידי שטיפת בארות עם RPMI חם מספר פעמים.
הוסיפו 500 מיקרוליטרים של מאגר ליזה למשך 10 דקות כדי ללכלך את המקרופאגים בבאר אחת מתוך הדגימה בת שלוש השעות, ואספו את הליזאט כדי לקבוע את שיעור ההדבקה הבסיסי. לאחר מכן הוסיפו RPMI מלא טרי ומינוני סמים נדרשים, או בקרת רכב, לבארות הנותרות. דגירה של הלוחות בחממת הפחמן הדו-חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד שמונה ימים, בהתאם לתכנון הניסוי.
כדי לקבוע את אחוז הזמן לחיוביות, או TTP, של האינוקולום הראשוני של הדגימה בת שלוש השעות, מרק מידלברוק חם ובקבוקי תרבית מכשירים לטמפרטורת החדר. מעבירים את המדיום מצלחת 12 הבאר לצינורות החרוטיים המסומנים המתאימים ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס סטרילי לכל באר. לאחר 10 דקות, בעדינות לגרד את התאים מן הבאר עם מגרד סטרילי ולשלב אותם עם המדיום בצינור החרוטי המתאים.
לאחר שהבאר נשטפת עם 0.5 מיליליטר של PBS סטרילי ובשילוב עם המדיום והליזאט, שוברים את הגושים על ידי העברת כל דגימה בעדינות דרך מזרק מחט של 25 מדים שש עד שמונה פעמים. דלל את הדגימה במרק MB על ידי הוספת 900 מיקרוליטר של מרק MB ל -100 מיקרוליטר של דגימה, וחזור על תהליך הקציר בנקודות הזמן הנדרשות במהלך הדגירה. הכינו את בקבוקי לוח המחוונים על ידי עיקור פקק הגומי ב-70% אלכוהול.
העבירו מספיק תוספי תזונה עבור כל הדגימות לתוך צינור חרוטי, והשתמשו במחט ובמזרק כדי להזריק 0.5 מיליליטר של תוסף תזונה לבקבוק תרבית המכשירים. לאחר מכן, פיפטה 500 מיקרוליטר של הדגימה המדוללת אחד מתוך 10 בצינור V תחתון מיליליטר אחד. השתמש במחט ובמזרק כדי להזריק את 500 המיקרוליטרים של הדגימה לבקבוקי תרבית המכשירים שהוקצו.
לאחר הובלה זהירה של הבקבוקים מארון הבטיחות הביולוגית למכשיר הטעינה, יש ללחוץ על כפתור ההעמסה במערכת האוטומטית לזיהוי מיקרוביאלי. סרקו את הברקודים על בקבוקי תרבית מכשירים והכניסו את הבקבוקים לחממה של מערכת הגילוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 42 יום. קרא והקלט את הזמן שנדרש כדי להגיע לחיוביות ממסך המכשיר וחשב את אחוז ה- TTP.
TTP חיובי מצביע על צמיחה מיקובקטריאלית. מכשיר התרבית הנוזלי האוטומטי עקב אחר רמות הפחמן הדו-חמצני כל 10 דקות וחישב TTP, שהוא מספר הימים מהחיסון ועד לסימון התרביות כחיוביות. הודגם קשר הפוך בין ערכי TTP וערכי log(10) של CFU באינוקולום הראשוני.
כאשר הושוותה צמיחה תוך-תאית של שחפת Mycobacterium בתוך מקרופאגים שנקבעה על ידי ספירת CFU לשיטת התרבית האוטומטית שתוארה, התקבל מתאם משמעותי בין התוצאות. צמיחת שחפת Mycobacterium הוצגה באופן גרפי על ידי השוואת ערכי ה- TTB עד שמונה ימים לאחר ההדבקה של מקרופאגים לערך ה- TTP הראשוני. מגמה דומה בין CFU לתרבית נוזלית הדגימה עיכוב משמעותי של צמיחת שחפת Mycobacterium במקרופאגים בנוכחות חומצה רטינואית כל-טרנסית, או AtRA, בתמיסה, או המינון המקביל של AtRA עטוף במיקרו-חלקיקים של PLGA.
ניסוי מינון-תגובה בוצע בתאי THP-1 נגועים כדי לקבוע את היעילות של האנטיביוטיקה Linezolid לבד, או את השילוב של linezolid ו אינטרפרון גמא. לא נצפתה אינטראקציה משמעותית בין התרופות. הכתמת AFP מאפשרת לנו להשתמש ב-MOI נמוך כדי למזער את המוות התאי בעת הדבקת מקרופאגים, ולהבטיח שימוש באותו MOI ללא קשר לטיפול שבו נעשה שימוש.
בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לזהות ולחקור תרופות נגד שחפת עופרת כדי לחקור את יעילותן in vivo.
