פרוטוקול זה משמעותי ביותר מכיוון שהוא מייצג את זרימת העבודה המתקדמת ביותר לניתוח גלובלי של מתילציה של חלבונים ארגינין על ידי ספקטרומטריית מסה. זוהי השיטה היחידה לזיהוי ופרופיל של חלבון R-מתילציה ברזולוציה בסגנון יחיד שאינה ניתנת להשגה בטכניקות ביוכימיות אחרות. בשילוב עם השימוש במעכבי PRMT, שחלקם נמצאים בניסויים קליניים ובתרופות אנטי-סרטניות, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מעמיק של מנגנון הפעולה שלהם.
כדי להתחיל, בצע הפחתה של קבוצת החלבונים תיול באמצעות תמיסת מלאי של DTT מומס במים אולטרה-פוריים בריכוז סופי של 4.5 מילימולאר ותן לתגובה ללכת במשך 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס. בצע אלקילציה של קבוצת החלבונים תיול על ידי הוספת יודואצטמיד בריכוז של 10 מילימולאר ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. כדי לוודא את יעילות הפרוטאוליזה, שמור אליקוט של תמצית חלבון לניתוח הבא על ג'ל מוכתם ב- SDS-PAGE Coomassie והשווה אותו לכמות הדגימה המתאימה בעת העיכול.
דלל את תמצית החלבון הנותרת עם ארבעה נפחים של 20 מילימולר HEPES ב- pH 8.0 כדי להגיע לריכוז אוריאה סופי של שתי טוחנות. פצל את הדגימה לשני חלקים, ולאחר מכן הוסף טריפסין שונה בדירוג רצף לאחד ופרוטאז LysargiNase לשני. השאירו את הדגימות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-ThermoMixer ב-600 סיבובים לדקה כדי לאפשר עיכול אנזימטי.
עבור כל שיפוע כרומטוגרפי, אסוף את כל השברים ללוח עמוק של 96 בארות. איחד את השברים שנאספו לפני תחילת ההדרגה לשבר אחד בודד בשם pre. שרשר את 60 השברים מהשיפוע הכרומטוגרפי הנוזלי בעל הפאזה ההפוכה ב- pH גבוה על-ידי איגוזם בצורה לא רציפה ל-14 שברים סופיים.
כדי לקבל שרשור לא רציף, אגד את שברי הפאזה ההפוכה בעלי ה-pH הגבוה כמתואר בכתב היד של הטקסט. איחד את השברים שנאספו לאחר ההדרגה לשבר ייחודי בשם פוסט. בצע העשרה רציפה של זיקה חיסונית של הפפטיד המהונדס בנפרד עבור שתי הדגימות מעיכול טריפסין ו- LysargiNase.
דלל את טיהור הזיקה החיסונית המרוכזת פי 10 או את חיץ ה-IAP 10 פעמים. צנטריפוגה פפטידים lyophilized ב 2, 000 G במשך חמש דקות כדי לסובב את הפפטידים לתחתית הצינור. השהה את הפפטידים עם 250 מיקרוליטרים של חיץ IAP מדולל לכל צינור 15 מיליליטר והעבר לצינור קשירה נמוך של 1.5 מיליליטר.
השתמשו בנייר ליטמוס כדי לבדוק שה-pH גדול משישה. שמור על אליקוט קטן של כל שבר כקלט לניתוח MS הבא. פצלו כל שבר לשני חלקים כדי לבצע את ההעשרה החיסונית של פפטידים שעברו דימתילציה אסימטרית, או ADMA, ודימתילאט סימטרי, או SDMA, במקביל.
הכינו שלושה בקבוקונים של הנוגדנים הנבחרים נגד פאן R-מתילציה המצומדים לחלבון A חרוזי אגרוז לכל 10 מיליגרם של תמצית החלבון הראשונית. הכן את הכמות הנכונה של נוגדנים מצומדים לחרוזי אגרוז על ידי צנטריפוגה של כל בקבוקון ב 2, 000 G במשך 30 שניות והסרת החיץ מן החרוזים. לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 1X PBS על ידי צנטריפוגה אותם ב 2, 000 G במשך 30 שניות.
לאחר הכביסה האחרונה, יש לתלות את החרוזים ב-40 מיקרוליטרים 1X PBS עבור כל בקבוקון, לאגור אותם ולבסוף לחלק אותם באופן שווה ל-16 שברים. הוסף 250 מיקרוליטרים של מאגר IAP 1X לכל צינור וערבב על ידי היפוך. ואז לדגור את הצינורות על גלגל מסתובב במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים פפטידים ונוגדן פאן R-מתיל חרוזים מצומדים ב 2, 000 G במשך 30 שניות כדי לזרוק את החרוזים ולהעביר את הזרימה מכל שבר לתוך צינור קשירה נקי 1.5 מיליליטר נמוך. הוסיפו את החרוזים לזרימה המצומדת לנוגדנים נגד מתילציה R-mono וחזרו על ההדחה ל-PBS, דגירה עם חיץ IAP וצנטריפוגה. במהלך הדגירה של דגימות הפפטידים עם חרוזי מונו-מתיליזציה או MMA, שטפו את השברים שהיו בעבר חיסוניים עם אנטי-ADMA ו-SDMA עם חיץ IAP של 250 מיקרוליטרים פעמיים והשליכו את הסופר-נטנט לאחר כל שטיפה.
לאחר מכן יש לשטוף במים בדרגה LC-MS שלוש פעמים. שדרגו את הפפטידים המועשרים של SDMA או ADMA מחרוזי האגרוז על ידי הוספת 50 מיקרוליטרים של 0.15 TFA לכל צינור. השאירו את הפתרון הזה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך הצינורות כל שתיים עד שלוש דקות.
מעבירים את האליציה הראשונה לצינורות קשירה נמוכים של 1.5 מיליליטר נקיים וחוזרים על האלוציה עם 50 מיקרוליטרים של 0.15 TFA. איחד את שני שברי האלוציה לצינור אחד. חזור על תהליך זה עבור פפטידים R-מונו-מתילציה שהודגרו עם חרוזי נוגדנים נגד MMA.
לאחר ערבוב התאים הקלים והכבדים, חלבונים הופקו והיו נתונים לעיכול על ידי טריפסין ו- LysargiNase. נעשה שימוש בג'ל מוכתם בקומסי SDS-PAGE כדי לאמת את העיכול האנזימטי היעיל של סך החלבונים בפפטידים. הוערכה היעילות של שלב הטיהור שבוצע על ידי טור C18 Sep-Pak, המאשר את היעדר הפפטידים בזרימה של עמודת C18 ובשטיפה הראשונה והשנייה, כמו גם את נוכחותם הצפויה ב- eluent.
נבחנו שילוב תקין של MET4 בערוץ הכבד וערבוב כבד או קל נכון. הכרומטוגרמה מהפירומטוגרפיה הנוזלית הלא מקוונת בעלת ה-pH הגבוה ההפוך של פפטידים ושרשור הלא רציף של שברים מוצגים כאן. פפטידים זוהו על ידי 250 ננומטר UV, בעוד חלבונים פוטנציאליים שנותרו מעוכלים הוערכו על ידי 280 ננומטר UV. התקבלו ספקטרום MS מלא של פפטידים המייצגים ביאור מתיל פפטיד חיובי אמיתי.
ההבדלים בין M ל-Z שנצפו בין שלוש הפסגות עולים בקנה אחד עם נוכחות של שאריות שעברו מתילציה אנזימטית. התקבלו ספקטרום MS מלא של פפטידים המייצגים ביאור מתיל פפטיד חיובי כוזב. ההבדלים בין M ל-Z שנצפו בין הפפטיד המתילציה הקל לבין מקבילו הכבד העונשי חורגים מהערך הצפוי ב-0.0312.
זרימת העבודה של הפרוטוקול היא ליניארית בסך הכל, אך ישנם כמה שלבים הדורשים תשומת לב מיוחדת. לדוגמה, הפרדת הכרומטוגרפיה של IPH עם שרשור שברים לא רציף, כמו גם הגדרת ה- IP. ניתן להצמיד את אותו פרוטוקול ל-SILAC סטנדרטי או לכימות ללא תוויות כדי ליצור פרופיל של דינמיקת מתילציה של ארגינין בתגובה למגוון הפרעות.
פרוטוקול זה סולל את הדרך לאפיון ההיקף והדינמיקה של מתילציה של חלבונים במספר סוגי תאים ומערכות מודל התומכות בכל ההיבטים של מחקר בסיסי ותרגומי המתמקד ב-PRMTs.
