העבודה במעבדת Januschke נתמכת על ידי מענקי נאמנות Wellcome 100031/Z/12/A ו- 1000032/Z/12/A. מתקן הדמיית הרקמות נתמך על ידי המענק WT101468 מ Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הדמיה חיה של מוח זחל הר D. melanogaster כולו מספק את ההזדמנות להתבונן חלוקות תאי גזע עצביים אסימטריים בתנאים קרובים להקשר פיזיולוגי. החלק הראשון של הפרוטוקול שלנו מציג את הגישה שלנו על ניתוח של מוחות זחל. כאמור13, היבט קריטי של ההכנה היא למנוע פגיעה במוח. ההיבט המאתגר ביותר של זה הוא להפריד את המוח מהדיסקים הדמיוני השכן מבלי למשוך יתר על המידה על המוח. הגישה שלנו ל"חיתוך ללא משיכה" היא לבצע תנועת שחיקה עם קצות זוג מלקחיים אחד, או להחליק מלקחיים לאורך שני קצות מלקחיים אחרים המחזיקים את הקשרבין רקמות ( איור 1A)ואילו לירית ואח 'מתארים תנועות דמויות מסור עם סיכה מנתחת. אנו מייעצים לנסיין לנסות את כל הגישות ולאמץ את המתאימה ביותר עבור עצמם. אנו מציעים גם להשתמש בטיפים לפיפט מצופה BSA או FCS במקום בכלי ניתוח להעברת מוחות מבודדים. הציפוי מונע מרקמות להידבק לפלסטיק ומאפשר העברה בטוחה של רקמות תוך שמירה עליהם שקועים לחלוטין, מבלי לחשוף אותם לעיוות חולף אפשרי כשהם נדבקים לכלי הניתוח במהלך ההעברה. טיפים מצופים יש יתרונות אחרים כדי לאפשר העברה של מספר מוחות בבת אחת, וזה שימושי במיוחד כאשר זה קריטי כדי לשלוט על זמן ההתמחות של הדגימות בתוך מדיום מסוים; הם מתאימים להעברת רקמות אחרות, אפילו שבריריות כמו, למשל, גופי שומן; הם יכולים להכיל מגוון רחב של גדלי מדגם שונים באמצעות טיפים גדולים יותר או חיתוך הקיצוניות של הקצה.
לאחר מכן, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בקרישת פיברינוגן כדי לשתק מוחות זחל על העטיפה של צלחת תרבות. המוח הוא מכוון בתוך טיפה של מדיום תרבות + פיברינוגן, ולאחר מכן קרישה נגרמת על ידי תוספת של תרומבין. היווצרות פיברין היא הדרגתית, ומספקת חלון זמן שבמהלכו ניתן לכוונן את כיוון הדגימה, במידת הצורך (איור 2C). אם נדרשת דחיסה קלה של המדגם - אשר אנו ממליצים נגד במקרה של מוח הזחל - זה יכול גם להיות מותאם דק על ידי לחיצה על הקריש פחות או יותר קרוב למדגם במהלך שלבים 3.4.4 ו 3.5.2. היתרון העיקרי של קרישת פיברינוגן זו על פני הפרוטוקול המתואר ב Lerit et al., שבו המוחות רכובים בין קרום חדיר גז ו coverslip, היא היכולת להחליף את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה. יתרון אפשרי של שימוש בקרום חדיר גז על הפרוטוקול שלנו יכול להיות שהוא מספק חמצון אופטימלי של הדגימות, אשר יכול להיות מוגבל יותר עם הגישה שלנו כמו המוח מופרדים מהאוויר על ידי קריש וכמה בינוני. מסיבה זו, למרות שלא הערכנו את ההשפעה של כמות המדיום התרבותי בתוך צלחת התרבות, אנו ממליצים להגביל את כמות המדיום התרבותי על גבי הקרישים תוך שמירה על קרישי דם שקועים לחלוטין.
מכיוון שהמניפולציה של הקרישים יכולה להיות קשה מבחינה ניסיונית ולגזול זמן רב, אנו ממליצים לנסיין לתרגל תחילה מניפולציה של קרישי דם ללא דגימות. לווסת את נפח הירידה של מדיום תרבות + פיברינוגן על כריכה, את הריכוז של פיברינוגן או את נפח וריכוז של תרומבין יכול לעזור להפוך את ההכנה קלה יותר יכול להיות חשוב בעת התאמת הפרוטוקול לסוגים אחרים של רקמות. עם מספיק ניסיון במניפולציה של הקרישים, מספר מוחות יכולים להיות משותקים בקריש אחד במידת הצורך, אם כי זה מסבך את הכוונון העדין של האוריינטציה. ניתן ליצור מספר קרישי דם על ה-coverslip, מה שמאפשר, למשל, לדגימות תמונה של גנוטיפים שונים. אפשר גם לחשוף קרישי דם שונים על אותו כיסוי למדיה תרבותית שונה, אם כי יש להקפיד לא לערבב את טיפות המדיום התרבותי המכסה את הקרישים השונים. ברגע שמוחות הזחל משותקים ומוכנים להדמיה חיה, אנו ממליצים לפעול בהתאם להמלצות של Lerit et al.13 כדי למנוע פוטו-סאונד מוגזם. אנו מוסיפים להמלצות אלה רק כדי לשמור על המוח ב 25 מעלות צלזיוס במהלך הדמיה חיה עם חממת במה, אלא גם כדי לחמם שלב זה לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה. בידיים שלנו, כישלון לעשות זאת באופן שיטתי גורם לסחף מיקוד חזק.
זה יכול להיות יתרון בהקשרים מסוימים כדי להיות מסוגל לבצע מיקרוסקופיה מתואמת לתקן ולדכא מדגם לאחר הדמיה חיה. עם זאת, מגבלה של שימוש בקרישי פיברין היא שכמעט בלתי אפשרי לבודד באופן מכני מוח מקריש דם מבלי לפגוע בו. דרך אפשרית להתגבר על מגבלה זו יכולה להיות לפתח שיטות להשפיל קרישי פיברין עם פלסמין או לגרום לפירוק קריש על ידי תוספת של פפטיד מחקה את הידיות המאפשרות פילמריזציה פיברין28. בדרך כלל אנו משתמשים בקרישי פיברין על דגימות הנעות בין תאים בודדים לרקמות באורך 200 מיקרומטר, אך אנו יכולים גם לשתק בהצלחה קרישי דם ומוחות תמונה מדבורים בוגרות ברוחב של מעל 3 מ"מ. הגבול העליון של גודל המדגם שניתן לשתק בקרישי דם נותר לקבוע. באופן דומה, למרות שאנחנו בדרך כלל תמונה דגימות משותקות במשך 4 עד 5 שעות, אנחנו בהצלחה הדמיה neuroblasts בתרבות העיקרית עד 3 ימים, המציין כי קריש לפחות לא מפריע הכדאיות לטווח ארוך יותר. להיפך, קרישי דם יכולים להקל על החלפה קבועה של המדיום, דרישה להדמיה לטווח ארוך יותר, ללא צורך במכשירים כגון משאבות פריסטלטיות למטרה זו. אמנם לא מדדנו את הפרמטרים החודרים של קרישי פיברין, אבל האופי הסיבי דמוי הג'ל של הקרישים נראה חדיר על ידי מולקולות חדירות לתאים. מצאנו כי Latrunculin A, Colcemid או 1-NAPP1, HALO-תג ligands וצבעים סטנדרטיים אחרים המשמשים בביולוגיה של התא להגיע לתאים בקריש פיברין ללא בעיות, עד כה לא נתקלו מולקולות כי יישמרו על ידי הקריש, אשר, עם זאת, היא אפשרות שיש לבדוק באופן אמפירי.
לסיכום, שימוש בקרישי פיברין מספק דרך אמינה וקלה יחסית ליישום דרך לשיתוק רקמות חיות להדמיה חיה. מעבר לתועלתה בהגבלת הסחף לרוחב, היכולת לשנות את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה הוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב בגישת הגנטיקה הכימית שלנו לחקר חלוקת התאים האסימטריים של D. melanogaster neuroblasts21. אנו צופים כי טכניקה זו תהיה מועילה למחקרים במגוון רחב של רקמות שונות, במיוחד אם הם כרוכים גנטיקה כימית או, למשל, חלבון עצמיתתיוג 29.
המאקרו MultiHyperStackReg שלנו מסתמך על תוסף TurboReg ImageJ, אשר מיישר מסגרות רצופות או פרוסות של מחסנית, ואת תוסף MultiStackReg ImageJ, המאפשר להחיל את המרות על ערימות אחרות. MultiHyperStackReg פשוט מאפשר להחיל טרנספורמציות אלה על hyperstacks (ערימות עם לפחות ארבעה ממדים). כמו השימוש MultiHyperStackReg, כפי שאנו מתארים את זה, דורש הרבה פעולות יכול לקבל די זמן רב, כתבנו גם את המאקרו AutoHyperStackReg, אשר מבצע באופן אוטומטי את כל השלבים המתוארים בשלבים 6.2 ו 6.3. עם זאת, בניגוד MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg כרגע חסר את האפשרות לחשב את היישור של מחסנית המבוססת על subregion של מחסנית זו, אפשרות שמצאנו הוא לפעמים חיוני עבור יישור מספק. מגבלה נוספת של AutoHyperStackReg היא כי השימוש בו מוגבל תרגומים ולא המרות אחרות המוצעות על ידי TurboReg ו MultiStackReg, ואילו MultiHyperStackReg יכול לחול על hyperstack כל סוג המרה אם המשתמש צריך את זה. מהדורות עתידיות ייישמו פונקציות אלה ויהיו זמינות ב- GitHub30. לבסוף, מאקרו הקווים המסתובב שלנו מספק דרך קלה למדוד במהירות אותות קליפת המוח בזמן פג, גם אם קליפת המוח משנה את מיקומה או את כיוונה לאורך זמן. בין אם מצב המעקב שלו או מצב אי המעקב שלו מתאים ביותר לניתוח תלוי באיכות ובעקביות של האות הקליפתי. מצב המעקב קל יותר לשימוש מכיוון שהמשתמש אינו צריך לשקול היכן תהיה קליפת המוח עבור כל נקודת זמן ויכול להכיל שינויים גדולים במיקום ובכיוון לאורך זמן. עם זאת, זה מתאים רק אם האות הקליפתי נשאר חזק מספיק לגילוי במהלך הסרט כולו: כישלון לזהות שום דבר אחר מאשר קליפת המוח (למשל, תא ציטופלזמי בהיר קרוב לקליפת המוח) יכול לסכן את הגילוי עבור כל נקודת זמן הבאה (למשל, התא הציטופלסמי מתרחק מקליפת המוח ואת הקווים קליפת המוח יכול לעקוב אחריו לשארית הזמן לשגות). למצב ללא מעקב אין את המלכודת הזו מכיוון שהזיהוי מוגבל לקו שצויר במקור על ידי המשתמש (למשל, תא ציטופלסמי בהיר עלול לגרום לגילוי להיכשל במשך כמה נקודות זמן, אך ככל שהתא הציטופלסמי מתרחק מאזור הגילוי, זיהוי נכון של קליפת המוח מתחדש), אך אינו מתנהג היטב אם מיקום קליפת המוח או הכיוון משתנים הרבה עם הזמן. התכונה הבאה (שתהיה זמינה ב- GitHub30) שתפותח עבור מצב המעקב תהיה האפשרות לנתח נקודות זמן שצוינו בלבד ולהגדיר נקודת זמן של הפניה (ולא את נקודת הזמן הראשונה) שלפניה ולאחריה יבוצע הזיהוי, מה שיאפשר למשתמש לפחות להימנע מנקודות זמן בעייתיות.

דרוזופילה ממשיכה להיות מערכת מודלים חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות והצטיינה בקידום ידע בדיסציפלינות רבות במשך עשרות שנים. תכונה אחת שגורמת לו להתבלט במיוחד היא שהוא מתאים במיוחד להדמיה חיה. היכולת לנטר תהליכים תת-תאיים או התנהגות תאים ורקמות בזמן אמת ממשיכה לתרום ליצירת מושגי מפתח הרלוונטיים לביולוגיה התאית וההתפתחותית. פרוטוקולים מוצלחים רבים פותחו על ידי קבוצות שונות כדי לשמור על דגימות Drosophila כאלה חיים ובריאים כדי ללמוד את ההתנהגות של הדגימה ומולקולות פלואורסצנטיות לחיות. איברים ורקמות מהזבוב כגון דיסקים דמיוניים1,2, מוח הזחל 3,4,5,6, או תאי ביצה של נקבות בוגרות7,8,9, או המעי הבוגר10 למשל ניתן לחלץ ושמור בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופ זמן לשגות. אתגר מרכזי להדמיה חיה הוא להבטיח שהדגימה תישמר קרוב למשטח ההדמיה לרזולוציה אופטימלית ושיתוק מבלי להתפשר על שלמות הדגימה שיכולה להיות רגישה להשפעות מכניות. כדי לחקור תאי גזע עצביים, הנקראים נוירובלסטים או נוירונים במוח הזחל Drosophila, למשל, שמירה על דגימות קרוב לפני השטח הדמיה יכול להיות מושגת על ידי כיסוי אותם עם מדיה תרבותית בתאי הדמיה אטומים11,12,13. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת בקלות חילופי מדיה ובכך מגבילה את מרחב התמרון הניסיוני. לחלופין, ניתן להכין ולהניח דגימות על כריכות שטופלו כדי להגביר את ההידבקות בתאים ולאפשר מיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית והדמיה ממושכת של תאים חיים במנות תרבות פתוחות, המאפשרות חילופי מדיה, אך אינן מספקות אמצעים קלים למניעת סחף או אובדן מדגם במהלך חילופי מדיה14,15.
שיטת קריש פיברין שפותחה במקור כדי ללמוד מיוזיס בזרעון עגורן חי16 מתאים במיוחד כדי להתגבר על בעיות אלה. פיברינוגן מומס במדיום תרבות רלוונטי, הדגימות ממוקמות ומכוונות בטיפה של פתרון זה על תא הדמיה זכוכית-משטח נאות לפני Thrombin מתווסף, וכתוצאה מכך היווצרות מהירה של קריש פיברין מסיס, רשת סיבית דביקה כי דבק משטח הזכוכית ואת הדגימות תוך הבטחת גישה של המדגם למדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להחליף את המדיום מבלי להטריד את מיקום הקריש או המדגם. חילופי תרבות בינוניים במהלך ההדמיה, למשל, רצויים כאשר יש להוסיף מעכבים כמו בשיטה המקורית או לניסויי שטיפה או מרדף דופק או כאשר יש להוסיף צבעים פלואורסצנטיים במהלך הדמיית תאים חיים תוך שמירה על תאים ורקמות במקום. קרישי פיברין מתאימים להדמיה של רקמות Drosophila, כמו גם תאים בודדים13,17. קרישי פיברין ניתן להשתמש עוד יותר כדי לעזור דגימות אוריינטציה, כי בשל צורתם או מאפיינים אחרים בדרך כלל לא יהיה מכוון בדרך הרצויה על ידי אפנון מיקום המדגם בתוך קריש פיברין ואת הצורה של הקריש עצמו.
כאן אנו מספקים עדכון על שיטות ההדמיה הנוכחיות שלנו המבוססות על קריש פיברין ומספקים כלים לניתוח תמונה מבוסס פילוח ומתמקדים בשימוש בשיטה זו כדי לחקור חטיבות נוירובלסט במוח הזבוב המתפתח. אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטת קריש פיברין כדי לעקוב אחר דגימות מרובות בקרישי דם שונים באותה צלחת תרבות. זה מאפשר i) הדמיה של אירועים תת תאיים כגון התנהגות centrosome או לוקליזציה mRNA לחיות18,19, ii) ניטור ההתנהגות של דגימות על טיפול תרופתי של גנוטיפים שונים תחת אותן הגדרות הדמיה באמצעות מיקרו ביקור רב נקודתיוסקופיה20, iii) לחקור את ההשפעות של עיכוב חריף שלאנזימים 21 ו iv) מזעור נסחף לחקור שינויים בכיוון של חלוקת התא של תאים בתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם על ממוקד לייזר אבלציה22. בעוד השפעות לא רצויות של תרומבין ופיברינוגן וקריש פיברין צריך להיבדק באופן אמפירי עבור כל מדגם, שיטה זו מתאימה עקרונית לשיתוק כל סוג של מדגם שיש לנתח על ידי הדמיית תאים חיים ובדרוסופילה שימש בהצלחה לחקר היבטים מרובים של ביולוגיה נוירובלסטים5,19,20אבל גם את הדינמיקה של תחזיות cytosensor של תאי גזע קו נבט נקבה23 ושינויים בקוטביות על עיכוב aPKC חריפה של תאי זקיק של תאי ביצה נקבה Drosophila 21.
הדמיה פלואורסצנטית של זמן לשגות גורמת ליצירת ערכות נתונים תלת-ממדיות מורכבות שנפתרו בזמן הדורשות שיטות לחילוץ מידע כמותי זה. כאן אנו מתארים את ההתפתחות הנוספת שלנו של24 פקודות מאקרו מבוססות ImageJ שניתן להשתמש בהן כדי לתקן להיסחף בהיפרסטקים ופקודות מאקרו מותאמות אישית של ImageJ המאפשרות כימות אוטומטי למחצה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית בקליפת המוח התאית שפותחה לכימות חלבונים קליפת המוח בנוירובלסטים של מוחות זחל דרוזופילה או של נוירובלסטים בודדים בתרבית התאים העיקרית.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

דרוזופילה היא מערכת מודל חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. איברים ורקמות שונים מהשלבים ההתפתחותיים השונים של הזבוב כגון דיסקים דמיוניים, מוח הזחל או תאי הביציות של נקבות בוגרות או המעי הבוגר יכולים להיות מופקים ונשמרים בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופיה לשגות בזמן, מתן תובנות חשובות על ביולוגיה תאית התפתחותית. כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול הנוכחי שלנו לניתוח מוחות הזחל של דרוזופילה, ולאחר מכן מציגים את הגישה הנוכחית שלנו לשיתוק וכוונת מוחות זחל ורקמות אחרות על מכסה זכוכית באמצעות קרישי פיברין. שיטת קיבוע זו דורשת רק תוספת של פיברינוגן ותרומבין למדיום התרבותי. היא מתאימה להדמיית זמן ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופים הפוכים של דגימות מרובות באותה מנה תרבותית, ממזערת את הסחף הלרוחב הנגרם לעתים קרובות על ידי תנועות של שלב המיקרוסקופ במיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית ומאפשרת הוספה והסרה של ריאגנטים במהלך ההדמיה. כמו כן, אנו מציגים פקודות מאקרו מותאמות אישית שבהן אנו משתמשים באופן שגרתי כדי לתקן להיסחף ולחלץ ולעבד מידע כמותי ספציפי מניתוח זמן לשגות.

קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין וחילופי תרבות בינוניים במהלך הדמיה חיה. לאחר שניתחו בעקבות ההליך שהוצג בשלב 2 (איור 1) ושיתוק בקרישי פיברין על אותו כיסוי בעקבות ההליך שהוצג בשלב 3 (איור 2), מוחות זחל המבטאים בזוקה מתויגת GFP (Baz::GFP), אורתולוגיית הזבובים של חלבון הקוטביות Par-3, צולמו במשך 30 דקות במיקום רב-תכליתי. באז::GFP משולב עם apkcas4, אלל המאפשר עיכוב חריף של חלבון לא טיפוסי קינאז C (aPKC) באמצעות תוספת של אנלוגי ATP קטן 1-NAPP120. 1-NAPP1 נוסף אפוא למדיום התרבות בעקבות ההליך שהוצג בשלב 4 וההדמיה החיה חודשה למשך 2.5 שעות. מוחות בקרה הנושאים גרסה פראית של ה- aPKC קינאז לא הגיבו לאנלוגי ATP, ואילו מוחות הנושאים בנוסף מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (apkcas4) הציגו התכווצות של הנוירופיתליום ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם ( איור6, וידאו 1). נוירובלסטים ממשיכים להתחלק לאורך כל הזמן, מה שמצביע על כך שהרקמה נשארת בריאה, ומוחות מראים מעט דריפט למרות השינוי הבינוני בתרבות, מה שמצביע על כך שהם משותקים היטב. באופן דומה, לאחר שנותחו בעקבות ההליך שהוצג ב27, ovarioles המבטא באז::GFP היו משותקים קרישי פיברין על אותו כיסוי ותמונה במשך 8 דקות, לאחר מכן יישום של 1-NAPP1 גרם התכווצות של APKCas4 תאים זקיקים מוטציה אבל לא של פקדים (איור 7, וידאו 2).
תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperstackReg. היפרסטאק המציג הן סחף רוחבי והן סחף מיקוד(וידאו 3,פאנל שמאלי) תוקן תחילה לסחף לרוחב (שלב 6.2, איור 3, וידאו 3, הפאנל האמצעי), ולאחר מכן התמקד בסחף (שלב 6.3, איור 4, וידאו 3, לוח ימני) באמצעות התוסף MultiStackReg והמאקרו MultiHyperstackReg, וכתוצאה מכך הפחתה משמעותית של התנועות שנצפו ב-
מדידת אותות קליפת המוח באמצעות סריקות קווים מסתובבות נוירובלסט המבטא את באז::GFP (ירוק) ואת חלבון transmembrane CD4 מתויג עם חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (CD4::mIFP, אדום) צולם במהלך מיטוזה אחת. אות ה-CD4::mIFP שימש כהפניה לגילוי קליפת המוח בחלקים שונים של הנוירובלסט עם קווים (שלב 7, איור 5, איור 8A-C)ואות ה-GFP נמדד בעמדות שזוהו איור 8D). במהלך החלוקה שלהם, נוירובלסטים מקוטבים באופן ארעי על ידי הקמת תחומים קליפתיים נפרדים ומנוגדים: הקוטב האפסי וקוטב הבסיס. באז מגדיר את הקוטב האפור, ובאופן עקבי, אות ה-GFP עלה בקוטב הנוירובלסט וירד בקוטב הבסיס במהלך החלוקה (איור 8C,D). המיקום של קליפת המוח היה במעקב מספק לאורך כל הזמן לשגות (איור 8C, וידאו 4). הקווים והגנוטיפים של דרוזופילה מוזכרים בטבלה משלימה 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> איור 6: יישום של אנלוגי ATP במוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה. (A) הדמיה חיה של שני מוחות זחל המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. מוחות בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו מוחות הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של הנוירופיתליום (ראשי חץ) ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם. הקרנת אינטנסיביות מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 23 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) הגדלה של הנוירופיתליום. סרגל קנה מידה: 10 μM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> איור 7: יישום של אנלוגי ATP בתאי ביצים משותקים במהלך הדמיה חיה. הדמיה חיה של שני אובריולים המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. תאי ביצה בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו תאי ביצה הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של האפיתל (ראשי חץ) שבסופו של דבר מובילים לפירוק לכאורה של צמתים דבקים. הקרנת עוצמה מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 27 מיקרומטר. סרגל <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank"></a> קנה מידה: 20 מיקרומטר.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> איור 8: מדידת האות הקליפתי באמצעות קווים מסתובבים. (A) לחיות D. מלנוגאסטר נוירובלסט מבטא באז::GFP (ירוק) ו CD4::mIFP (אדום). קווי ציאן: קווי סריקה ראשוניים נעוצים בניצב לאזורים קליפתיים שונים למדידה. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר (B) זיהוי של קליפת המוח (קו כחול כהה) באמצעות אוניות קליפת המוח ו- CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. קו תכלת: אזור המוגדר על ידי הפרמטר "מדוד מסביב" (כאן, 2 פיקסלים), שבו האות נמדד לאחר זיהוי קליפת המוח. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר (C) ציאן: אזורים קליפתיים שזוהו במהלך חלוקה נוירובלסט על ידי שיטת הקווים המסתובבים מקווי הסריקה הראשוניים המוצגים ב- (A), באמצעות CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. חץ: מוט apical. ראש חץ: מוט בסיס. (D) מדידה של באז::עוצמת אות GFP לאורך זמן בשני האזורים המתאימים המזוהים על ידי קווים מסתובבים המוצגים ב- (C). במהלך המיטוזיס, באז::GFP מקבל מועשר באופן ארעי בקוטב apical של neuroblast והוא מרוקן מקוטב הבסיס הנגדי. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: יישום של חילופי מדיה על מוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 6, סרגל קנה מידה: 20 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">מיקרומטר.</a>
וידאו 2: יישום של חילופי מדיה על תאי ביצה משותקים במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 7, סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank"></a>
וידאו 3: תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperStackReg. הדמיה חיה של נוירובלסט המבטא את בדיקת הממברנה PH::GFP. מישור מוקד יחיד. Xz: שריד אורתוגונלי. משמאל: לפני תיקון הסחף. אמצע: לאחר תיקון הסחף לרוחב. מימין: לאחר תיקון הסחף לרוחב המיקוד, סרגל קנה המידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו הזה.</a>
וידאו 4: זיהוי קליפת המוח באמצעות קווים מסתובבים, המוצג באיור 8, סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank"></a>
טבלה משלימה 1: גנוטיפים של רקמות דרוזופילה דימוי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ קידוד משלים 1: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 3: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Views.  University of Dundee. פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengineering

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

לדמיין את חיים תסיסנית גליה-neuromuscular צומת עם צבעי ניאון

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biology

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב