המחברים מבקשים להודות לכל קונסורציום ACEnano על דיונים פוריים לאורך כל שלבי הכנת הפרוטוקול המוצג כאן. המחברים מעריכים גם מימון מתוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (H2020) במסגרת הסכם המענק nº 720952 במסגרת פרויקט ACEnano.

כל המחברים של כתב יד זה הם עובדים של Postnova Analytics GmbH, שמוצריה מנוצלים בפרוטוקול זה.

הגודל ההידרודינמי של AuNP לא ידוע הוערך במדויק על ידי AF4 יחד עם גלאי UV-vis באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב של AuNP הנעים בין 20 ננומטר ל -100 ננומטר. שיטת AF4 המפותחת עברה אופטימיזציה באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על מנת ליצור קשר ליניארי בין זמן שמירה מדוד לגודל AuNP, ובכך לאפשר קביעת גודל פשוטה מניתוח רגרסיה ליניארית. התמקדות מיוחדת הייתה גם בהשגת שיעורי התאוששות גבוהים מספיק המציין שום אובדן מדגם משמעותי במהלך השבר, וכי שיטת AF4 שפותחה, כולל האלונט המוחל והממברנה התאימה היטב עם כל דגימות AuNP מופרדות.
פיתוח שיטה הוא ללא ספק הצעד הקריטי ביותר ב- AF4 וכמה פרמטרים, כולל ממדי ערוץ, פרמטרי זרימה, כמו גם eluent, קרום, גובה מרווח, ואפילו תכונות מדגם יש לקחת בחשבון על מנת לשפר את השבר בתוך חלון זמן elution נתון. מטרת פסקה זו היא להנחות את הקורא לאורך השלבים הקריטיים שמוטבו כדי לקבוע בהצלחה את גודל מדגם AuNP הלא ידוע הנדון כאן. לתיאור מפורט יותר של איך בדרך כלל לפתח שיטת AF4, הקורא מתייחס לסעיף AF4 של 'ISO /TS21362:2018 - Nanotechnologies - ניתוח של ננו-אובייקטים באמצעות זרימה אסימטרית ושבר זרימת שדה צנטריפוגלי'25. לאחר מבט מקרוב על תנאי השבר החלים שניתנו בטבלה 3, הצעד הקריטי הראשון הוא הקדמה והרפיה של מדגם AuNP בערוץ AF4. שלב זה נשלט על ידי זרימת ההזרקה, זרימת המיקוד והזרימה הצולבת, אשר יחסי הגומלין שלהם מאלצים את המדגם לאתר קרוב לפני השטח של הממברנה ולרכז אותו ברצועה צרה ליד יציאת ההזרקה של ערוץ AF4 בעצם הגדרת נקודת ההתחלה של השבר. הרפיה מספקת של המדגם היא חובה כמו במהלך שלב זה, מדגם מרכיבים בגדלים שונים לאתר בגבהים שונים של ערוץ AF4 ובכך לספק את הבסיס לשבר גודל מוצלח. הרפיה מדגם לא שלם הוא בדרך כלל גלוי על ידי שטח שיא חלל מוגבר הנובע מרכיבים מדגם unretained (כלומר, לא רגוע). ניתן לצמצם אפקט זה על-ידי הגדלת זמן ההזרקה ו/או קצב הזרימה הצולבת המוחל. עם זאת, שני הפרמטרים זקוקים לאופטימיזציה זהירה, במיוחד עבור דגימות הנוטות להתלכדות וספיחות על קרום AF4, וניתן לפקח עליהם על ידי שיעורי השחזור המתאימים המתקבלים עבור הגדרות פרמטר שונות36,37. זמן ההזרקה החל של 5 דקות יחד עם קצב זרימה צולבת של 1.0mL∙min-1 גילה שיעורי התאוששות >80% עבור כל דגימות AuNP ואזור שיא חלל זניח המציין תנאי הרפיה כמעט אופטימליים. לאחר הרפיה מספקת של מדגם AuNP, זרימת המיקוד הופסקה והובלת מדגם לאורך ערוץ AF4 לגלאי UV-vis בהתאמה החלה המייצגת את הצעד הקריטי השני. על מנת להבטיח כוח שבר גבוה מספיק בזמני ניתוח סבירים, קצב זרימה צולבת קבוע של 1.0 mL∙min-1 למשך 30-50 דקות (בהתאם לתקן גודל AuNP המוקטן בהתאמה) ואחריו ריקבון זרימה צולבת ליניארית של 10 דקות בקצב זרימת גלאי של 0.5 מ"ל.min-1 הוחל. באמצעות פרופיל זרימה צולבת קבוע על פני ההפרדה של כל תקני גודל AuNP גילה קשר ליניארי בין זמן שמירה לגודל AuNP בעקבות FFF-Theory22, ובכך לאפשר קביעת גודל של מדגם AuNP לא ידוע על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית פשוטה. עם זאת, פרופילים שאינם זרימה צולבת מתמדת נוצלו גם לשינוי גודל של חלקיקים, ובסופו של דבר מובילים ליחסים לא ליניאריים בין זמן השמירה לגודל החלקיקים38,39. בנוסף, קביעת גודל AF4 באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב אינה מוגבלת AuNP, אבל יכול להיות מיושם גם על חלקיקים עם גדלים אחרים הרכב אלמנטלי (למשל, כסף38,40 או חלקיקי סיליקה41,42). בנוסף, כאשר עובדים עם דגימות מדוללות, ICP-MS הוא גלאי יסוד רגיש מאוד, אשר ניתן לצמיד עם AF4, הוספת צדדיות של גישה אנליטית זו לשינוי גודל של מגוון גדול של חלקיקים בהשעיה.
למרות היישום הנרחב שלה, כיול גודל חיצוני באמצעות תקני גודל מוגדרים היטב AF4 יש כמה מוזרויות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בו עבור גודל מדויק של דגימות לא ידועות. קודם כל, זה מסתמך במידה רבה על היישום של תנאים דומים במהלך השבר של תקני הגודל בהתאמה ואת המדגם בפועל. במקרה המוצג כאן, לכן חובה כי הן את תקני גודל AuNP, כמו גם את מדגם AuNP לא ידוע מופרדים באמצעות אותה שיטת AF4, כמו גם את אותה התרוממות רוח ואותו קרום מה שהפך גישה זו לבלתי גמישה למדי. יתר על כן, ללא גלאים רגישים לגודל, למשל, פיזור אור (MALS ו- DLS) בהישג יד, קשה לקבוע אם שיטת AF4 בהתאמה באמצעות תקני גודל עובד מספיק טוב או לא. זה נכון במיוחד עבור דגימות לא ידועות המציגות התפלגויות גודל רחבות מאוד, שם עדיין לא ברור אם כל המרכיבים מדגם בצע את דפוס elution נורמלי: שבר מחלקיקים קטנים יותר לגדולים יותר, או אם מרכיבי מדגם גדולים כבר elute במצב סטריק-hyperlayer ובכך פוטנציאל co-eluting עם מרכיבים מדגם קטןיותר 43,44. בנוסף, למרות FFF-התיאוריה מדגישה כי AF4 מפריד אך ורק על בסיס הבדלים בגודל הידרודינמי עם חלקיקים נחשבים מסות נקודה ללא כל אינטראקציות עם הסביבה שלהם22, המציאות מספרת סיפור אחר עם חלקיק חלקיקים וחלקיקים-לי אינטראקציות ממברנה (כגון משיכה אלקטרוסטטית / דחייה או ואן דר-ואלס אטרקציה) עשוי לשחק תפקיד ניכר והוא יכול להציג הטיה מדידה לתוך קביעות גודל באמצעות כיול גודל חיצוני45,46. לכן מומלץ להשתמש בתקני גודל התואמים באופן אידיאלי את הרכב ואת תכונות פני השטח (פוטנציאל זטה) של החלקיק שלעניין 40,42 או, אם אלה אינם זמינים, לפחות להשתמש בתקני גודל חלקיקים מאופיינים היטב (למשל, חלקיקי לטקס פוליסטירן) ולהעריך בזהירות את ההשלמות שלהם עם החלקיק של עניין במיוחד במונחים של פוטנציאל זטה פני השטח שלהם בסביבה המתאימה, שבו הניתוח יבוצע41,47.
הרבגוניות של AF4 נחשבת לעתים קרובות לעוצמתה הגדולה ביותר, שכן היא מציעה טווח יישומים החורג מרוב טכניקות הגודל הנפוצות האחרות בתחום זה22,48,49. עם זאת, בשל המורכבות הנלווית אליו, הוא עשוי להיחשב גם כחיסרון המשמעותי ביותר שלו במיוחד נגד טכניקות שינוי גודל מהירות וקלות לשימוש לכאורה כגון DLS, ניתוח מעקב חלקיקים או חלקיק יחיד ICP-MS. עם זאת, כאשר מכניסים את AF4 לפרספקטיבה עם טכניקות שינוי גודל פופולריות אלה, מתברר כי לכל הטכניקות יש את היתרונות והחסרונות שלהן, אך כולן תורמות להבנה מקיפה יותר של האופי הפיזיו-כימי של חלקיקים ולכן יש לראות בהן משלימות ולא תחרותיות.
נוהל הפעולה הסטנדרטי (SOP) המוצג כאן, מדגיש את הישימות המצוינת של AF4-UV-vis עם כיול גודל חיצוני לשינוי גודל של מדגם AuNP לא ידוע בהשעיה ובסופו של דבר הוחל כקו מנחה מומלץ לניתוח AF4 של מדגם AuNP לא ידוע בתוך השוואה בינלאומית interlaboratory (ILC) שנערך במסגרת פרויקט Horizon 2020, ACEnano (התוצאה של ILC זה יהיה הנושא של פרוטוקול זה, אם כן, מסתכם במאמצים הבינלאומיים המעודדים והמתמשכים לאמת ולתקנן מתודולוגיות AF425,50,51,52 המדגישות את הפוטנציאל המבטיח של AF4 בתחום אפיון הננו-חלקיקים.

חלקיקי זהב (AuNP) בצורה של זהב קולואידי היו חלק מתרבות האדם הרבה לפני שהייתה הבנה של מה הם חלקיקים ולפני שהמונח חלקיקים מצאו את דרכם לאוצר מילים מדעי עכשווי. ללא ידע ברור על המראה הננומטרי שלהם, AuNP מושעה כבר שימש למטרות רפואיות ואחרות בסין העתיקה, ערב, והודו במאות V-VI לפני הספירה1, וגם הרומאים העתיקים ניצלו את צבעם האדום האודם כדי להכתים את כלי החרס שלהם בתערוכת גביע Lycurgus במוזיאון הבריטי2. בעולם המערבי, לאורך מאות שנים מימי הביניים ועד העידן המודרני, AuNP מושעה שימשו בעיקר כסוכני צביעה עבור זכוכית ואמייל (סגול של קאסיוס)3, כמו גם לטיפול במגוון מחלות (זהב ראוי לשתייה), במיוחד עגבת4.
עם זאת, כל המחקרים הללו התמקדו בעיקר ביישום של AuNP מושעה וזה היה תלוי מייקל פאראדיי בשנת 1857 כדי להציג את הגישה הרציונלית הראשונה לחקור את היווצרותם, טבעם, כמו גם את המאפיינים שלהם5. למרות פאראדיי כבר היה מודע לכך AuNP אלה חייב להיות ממדים דקה מאוד, זה לא היה עד הפיתוח של מיקרוסקופ אלקטרונים כאשר מידע מפורש על התפלגות הגודל שלהם היה נגיש6,7, בסופו של דבר המאפשר את המתאם בין גודל ומאפיינים אחרים AuNP.
כיום, הודות לסינתזה קלה ופשוטה למדי שלהם, תכונות אופטיות מדהימות (תהודה פלסמון פני השטח), יציבות כימית טובה ובכך רעילות מינורית, כמו גם צדדיות גבוהה שלהם במונחים של גדלים זמינים ושינויים פני השטח, AuNP מצאו יישומים נרחבים בתחומים כגון nanoelectronics8,אבחון 9, טיפול בסרטן10, או משלוח סמים11. ברור, עבור יישומים אלה, ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של AuNP להחיל הוא תנאי מוקדם בסיסי כדי להבטיח יעילות אופטימלית12 ויש ביקוש משמעותי עבור כלים חזקים ואמינים כדי לקבוע את הפרמטר הזה physico-כימי מכריע. היום, יש שפע של טכניקות אנליטיות המסוגלות לשנות את גודל AuNP בהשעיה כולל, לדוגמה, ספקטרוסקופיית UV-vis (UV-vis)13, פיזור אור דינמי (DLS)14 או ספקטרומטריית מסה פלזמה משולבת UV-vis (spICP-MS)15 עם שבר זרימת שדה (FFF) להיות שחקן מפתח בתחום זה16,17,18,19,20.
הומשג לראשונה בשנת 1966 על ידי J. קלווין גידינגס21, FFF כולל משפחה של טכניקות שבר מבוסס elution, שבו ההפרדה מתרחשת בתוך ערוץ דק, כמו סרט ללא שלב נייח22,23. ב- FFF, ההפרדה נגרמת על ידי אינטראקציה של מדגם עם שדה כוח חיצוני הפועל בניצב לכיוון זרימת ערוץ למינאר, שבו המדגם מועבר במורד הזרם בדרך כלל לכיוון גלאים בשורה בהתאמה. בין טכניקות FFF קשורות אלה, שבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי (AF4), שבו זרימה שנייה (זרימה צולבת) משמש כשדה הכוח, הפך לסוג המשנה הנפוץ ביותר24. ב- AF4, תחתית הערוץ (קיר הצטברות) מצוידת בקרום סינון אולטרה-סינון הניתן למחצה המסוגל לשמור על הדגימה ובו זמנית לאפשר לזרימת הצלב לעבור דרך הממברנה ולהשאיר את הערוץ דרך שקע נוסף. באמצעות זה, הזרימה הצולבת יכולה לדחוף את המדגם לכיוון קיר ההצטברות ובכך לנטרל את השטף הנגרמת על ידי דיפוזיה (תנועה בראוניאנית). בשיווי משקל וכתוצאה מכך של שטף שדה ופיזור-induced; מרכיבי מדגם קטנים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה גבוהים יותר מתיישרים קרוב יותר למרכז התעלה, בעוד מרכיבי מדגם גדולים יותר המציגים מקדמי דיפוזיה נמוכים יותר מאתרים קרוב יותר לקיר ההצטברות. בשל פרופיל הזרימה הפרבולית בתוך הערוץ, מרכיבי מדגם קטנים יותר מועברים אפוא בלמינה המהירה יותר של זרימת התעלה ו elute לפני מרכיבי מדגם גדולים יותר. באמצעות פרמטר שימור FFF ומשוואות מקדם דיפוזיה סטוקס-איינשטיין, זמן ההעלאה, בהתאמה נפח elution, של מדגם AF4 אז יכול להיות מתורגם ישירות לגודל הידרודינמי שלה22. כאן התנהגות elution המתואר מתייחס למצב elution נורמלי והוא תקף בדרך כלל עבור AF4 בתוך טווח גודל החלקיקים בין כ 1-500 ננומטר (לפעמים עד 2000 ננומטר בהתאם למאפייני חלקיקים ופרמטרים שבר) ואילו elution סטריק-hyperlayer מתרחשת בדרך כלל מעל סף גודל זה25.
קיימות שלוש דרכים נפוצות להפקת מידע גודל לאחר ההפרדה על-ידי FFF. מאז FFF הוא מכשיר מודולרי, זה יכול להיות משולב במורד הזרם עם גלאים מרובים כגון גלאי פיזור אור רגישים לגודל המבוססים על העיקרון של פיזור אור רב זוויתי (MALS)26,27, פיזור אור דינמי (DLS)28,29, או אפילו שילוב של שניהם כדי לקבל מידע צורה נוסף30,31. עם זאת, מאז התנהגות השמירה של מדגם בערוץ FFF נשלטת בדרך כלל על ידי כוחות פיזיים מוגדרים היטב, גודל יכול גם להיות מחושב באמצעות גישה מתמטית (תורת FFF), שבו גלאי ריכוז פשוט (למשל, גלאי UV-vis) מספיק כדי להצביע על נוכחות של מדגם eluting32,33.
כאפשרות שלישית, אנו מדווחים כאן על יישום של כיול גודל חיצוני34,35 באמצעות תקני AuNP מוגדרים היטב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע במתלה באמצעות AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis. מערך ניסיוני פשוט זה נבחר בכוונה כדי לאפשר לכמה שיותר מעבדות להצטרף להשוואה בינלאומית בין-לאומית (ILC), שבוצעה מאוחר יותר במסגרת פרויקט אופק 2020 של האיחוד האירופי ACEnano על סמך הפרוטוקול המוצג כאן.

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Used for filtration of aqueous solutions</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Used for filtration of NovaChem100</td></tr><tr><td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>AF4 cartridge</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Channel Oven</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Crossflow Module</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF Control Module</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Disposable Pipette Tips (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Used for eluent storage</td></tr><tr><td>Focus Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td></tr><tr><td>Magnetic Stirrer</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td></tr><tr><td>Personal Computer (PC)</td><td>Dell Technologies</td><td>/</td><td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td><td>/</td><td>/</td><td>In accordance with respective laboratory&amp;rsquo;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td></tr><tr><td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &amp;ge;99 %, Blotting Grade</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>2326.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &amp;ge;98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>6771.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Software Package for Control and Data Acquisition</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaFFF AF2000 Software</td><td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Software Package for Data Evaluation</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaAnalysis Software</td><td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td></tr><tr><td>Software Package for final Data Processing</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Used for final data processing</td></tr><tr><td>Solvent Degasser</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Selector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Organizer</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Surfactant Mixture</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td></tr><tr><td>Tip Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Unknown AuNP sample</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC60</td><td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td></tr><tr><td>UV-vis Detector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td></tr><tr><td>Vacuum Filtration Unit</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Eluent Filtration System</td><td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&amp;Omega;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td></tr></tbody></table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

גודל החלקיקים הוא ללא ספק הפרמטר הפיזיקו-כימי החשוב ביותר הקשור לרעיון של חלקיק. ידע מדויק של התפלגות גודל וגודל של חלקיקים הוא בעל חשיבות עליונה עבור יישומים שונים. טווח הגודל חשוב גם, שכן הוא מגדיר את המרכיב "הפעיל" ביותר של מינון ננו-חלקיקים.
שבר זרימת זרימה אסימטרי (AF4) היא טכניקה רבת עוצמה לשינוי גודל של חלקיקים בהשעיה בטווח הגודל של כ 1-1000 ננומטר. קיימות מספר דרכים להפיק מידע גודל מניסוי AF4. מלבד צימוד AF4 באינטרנט עם גלאים רגישים לגודל המבוססים על העקרונות של פיזור אור רב זוויתי או פיזור אור דינמי, יש גם את האפשרות לתאם את הגודל של מדגם עם זמן השמירה שלה באמצעות גישה תיאורטית מבוססת היטב (תאוריית FFF) או על ידי השוואתו עם זמני השמירה של תקני גודל חלקיקים מוגדרים היטב (כיול גודל חיצוני).
אנו מתארים כאן את הפיתוח ואת האימות בתוך הארגון של הליך פעולה סטנדרטי (SOP) לשינוי גודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע על ידי AF4 בשילוב עם זיהוי UV-vis באמצעות כיול גודל חיצוני עם תקני חלקיקי זהב בטווח הגודל של 20-100 ננומטר. הליך זה מספק תיאור מפורט של זרימת העבודה שפותחה כולל הכנת מדגם, הגדרת מכשיר AF4 והסמכה, פיתוח שיטת AF4 ושבר של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע, כמו גם את המתאם של התוצאות שהתקבלו עם כיול גודל חיצוני הוקמה. ה- SOP המתואר כאן אומת בסופו של דבר בהצלחה במסגרת מחקר השוואה interlaboratory המדגיש את החוסן והאמינות המצוינים של AF4 לשינוי גודל של דגימות ננו-חלקיקים בהשעיה.

ראשית, תקני גודל AuNP היו מופרדים על ידי AF4 וזוהו על ידי UV-vis מדידת הספיגה של AuNP באורך גל של 532 ננומטר (תהודה פלסמון פני השטח של AuNP). כיסוי של הפרקטוגרמות המתקבלות מוצג באיור 1. זמני השמירה של כל AuNP בשיא UV-vis בהתאמה שלה המרבי המתקבל ממדידות משולשות מפורטים בטבלה 5. סטיית התקן היחסית של כל זמני השמירה הייתה מתחת ל-1.1% עם סטיית מדידה פוחתת עם הגדלת הגודל. בסך הכל הושגה חזרה מצוינת. כוח הפרדה מתמיד הופעל, מה שגרם למערכת יחסים ליניארית של זמן elution וגודל הידרודינמי. קו הכיול של הגודל החיצוני הוקם על-ידי התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן הריק המתוקן של זמן ההקצנה (זמן שמירה נטו). ניתוח רגרסיה ליניארית הביא לפונקציית כיול ליניארית עם יירוט a = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ושיפוע b = 1.209 ננומטר∙ מינימום-1 ± 0.055 nm∙min-1. ההתנהגות הליניארית של elution אושרה עם מקדם מתאם בריבוע R2 של 0.9958. פונקציית הכיול המתאימה מוצגת באופן חזותי באיור 2.
החלק השני עסק בניתוח מדגם AuNP לא ידוע. שלושה אלציטוטים של המדגם הוכנו בהתאם לנוהל המתואר בסעיף הפרוטוקול (סעיף 4.2). כל אחד משלושת aliquots נחקר משולש באמצעות אותה שיטת שבר AF4 כי הוחל גם על תקני גודל AuNP. כל תשעת הפרקטוגרמות AF4-UV-vis שהתקבלו מדגם AuNP הלא ידוע מוצגות באיור 3 וההערכות שלהן מסוכמות בטבלה 6. סטיית התקן היחסית של זמני השמירה בהתאמה הייתה נמוכה משמעותית וננועה בין 0.1% ל-0.5%. באמצעות פונקציית כיול גודל החלקיקים המתקבלת מהשבר של תקני הגודל של AuNP ומתאימה אותו עם זמני השמירה המתקבלים של מדגם AuNP הלא ידוע בשיא המרבי של UV-vis, ניתן לחשב רדיוס הידרודינמי ממוצע כולל של 29.4 ננומטר ± 0.2 ננומטר. יתר על כן, התאוששות המונית סבירה של 83.1% ± 1.2% הושגה המציין שום agglomeration משמעותי או פירוק של מדגם AuNP או ספיחה ניכרת של חלקיקים על פני השטח של הממברנה. איור 4 מציג את התפלגות גודל החלקיקים המתקבלת עם כל תשעת עקבות האותות של UV-vis בממוצע המדגישות את החוסן המצוין של שיטת AF4 שהוחלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> איור 1: AF4-UV-vis fractograms המתקבלים מניתוח משולש של ארבעת תקני הכיול הבודדים בגודל AuNP עם עוצמות אותות מנורמלות וקצב זרימה צולבת קבוע (קו שחור). שיא החלל מודגש באפור בסביבות 5.9 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">דקות.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> איור 2: פונקציית כיול גודל חיצוני שהתקבלה, כולל קווי שגיאה הנגזרים מסטיות התקן המתאימות של מדידות DLS ( טבלה 4 ) ושונות בזמני השמירה המתקבלים של AF4 (טבלה 5), לאחר התוויית הרדיוס ההידרודינמי שצוין כנגד זמן השמירה של כלתקןכיול גודל AuNP בודד בשיאו המרבי. פונקציית כיול ליניארית עם שגיאות סטנדרטיות בצורת y = a + bx עם = -3.373 ננומטר ± 1.716 ננומטר ו- b = 1.209 nm·min-1 ± 0.055 nm·min-1 חושב מניתוח רגרסיה ליניארית. נקבע מקדם מתאם בריבוע עם R2 = 0.9958, המציין קשר גומלין ליניארי. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> איור 3: AF4-UV-vis fractograms של מדידות משולשות של שלושה aliquots המציג את AuNP לא ידוע. קצב הזרימה הצולבת הקבוע המוחל לאורך זמן המדידה מאויר כקו שחור. שיא החלל בסביבות 5.9 דקות מודגש באפור. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> איור 4: כיסוי של התפלגות גודל החלקיקים הממוצע המתקבל (אדום) של מדגם AuNP לא ידוע ופונקציית הכיול הליניארית המוחלת (קו מנוקד). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">רכיב</td>
			<td>CAS-לא</td>
			<td>משקל (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">מים</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">9-Octadecenoic חומצה (Z)-, תרכובת עם 2,2 ',2'-nitrilotris[אתנול](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">נתרן קרבונט</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">אלכוהול, C12-14 משני, אתוקסילי</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טטרסודיום אדטה</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">פוליאתילן גליקול</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">נתרן אולאט</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">סודיום ביקרבונט</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רשימת המרכיבים של תערובת פעילי שטח המשמש להכנת eluent (ראה גם טבלה של חומרים).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרי AF4-UV-vis</td>
			<td>יחידת</td>
			<td>ערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>עובי מרווח</td>
			<td>מיקרומטר</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה של גלאי</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה צולבת</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0 (קבוע במשך 8 דקות)</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימת מיקוד</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן השהיה / זמן ייצוב</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב הזרמת הזרקה</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן מעבר</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן הזרקה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב אלויון</td>
			<td>דקות</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן שלב שטיפה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטף את קצב זרימת הצעדים</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח הזרקה</td>
			<td>μL (μL)</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז דגימה</td>
			<td>מ"גL-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג ממברנה</td>
			<td></td>
			<td>תאית מחדש</td>
		</tr>
<tr>
<td>ממברנה מולקולרית משקל מנותק</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלונט (שני)</td>
			<td></td>
			<td>תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך גל UV-vis</td>
			<td>ננומטר</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>רגישות UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת ההזרקה הישירה ללא יישום של כוח הפרדה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פרמטרי AF4-UV-vis</td>
			<td>יחידת</td>
			<td>ערך</td>
		</tr>
<tr>
<td>עובי מרווח</td>
			<td>מיקרומטר</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה של גלאי</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימה צולבת</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>1 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב זרימת מיקוד</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן השהיה / זמן ייצוב</td>
			<td>דקות</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>קצב הזרמת הזרקה</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן מעבר</td>
			<td>דקות</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן הזרקה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב אלויון</td>
			<td>דקות</td>
			<td>70 (קבוע 60 דקות, 10 דקות ליניארי)</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב שטיפה</td>
			<td>דקות</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>שטף את קצב זרימת הצעדים</td>
			<td>mL מינימום-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>נפח הזרקה</td>
			<td>μL (μL)</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריכוז דגימה</td>
			<td>מ"גL-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>סוג ממברנה</td>
			<td></td>
			<td>תאית מחדש</td>
		</tr>
<tr>
<td>ממברנה מולקולרית משקל מנותק</td>
			<td>kDa</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>אלונט (שני)</td>
			<td></td>
			<td>תערובת פעילי שטח 0.025% (v/v)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אורך גל UV-vis</td>
			<td>ננומטר</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>רגישות UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: סיכום הפרמטרים של שיטת השבר AF4-UV-vis כדי לבצע את ריצת השבר עם יישום של זרימה צולבת ככוח הפרדה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תקן כיול</td>
			<td>סוכן מכסה</td>
			<td>גודל ממוצע (TEM) (nm)</td>
			<td>קורות חיים (גודל ממוצע TEM) (%)</td>
			<td>זטה פוטנציאל (mV)</td>
			<td>SD (פוטנציאל זטה) (mV)</td>
			<td>רדיוס הידרודינמי (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (רדיוס הידרודינמי) (nm)</td>
			<td>PDI</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 ננומטר</td>
			<td>ציטראט (ציטראט)</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 4: סיכום הפרמטרים הפיזיו-כימיים של תקני הכיול החלים של AuNP, כולל סוכן מכסה, גודל ממוצע של TEM, פוטנציאל זטה שנקבע בהשעיה המקורית, כמו גם רדיוס הידרודינמי של DLS, ומדד פולידיספרסיטי (PDI) שנקבע בהשעיה האמידה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תקן כיול</td>
			<td>להפעיל</td>
			<td>זמן שמירה בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו ממוצע (מינימום)</td>
			<td>SD (%) (זמן שמירה נטו)</td>
			<td>SD (מינימום) (זמן שמירה נטו)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 ננומטר</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 5: זמני השמירה של תקני הכיול של AuNP בשיא UV-Vis בהתאמה נגזרו מהפרקטוגרמות המתאימות של AF4-UV-vis בשיטה המתוארת בטבלה 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אלציטוטה</td>
			<td>להפעיל</td>
			<td>זמן שמירה מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה ממוצע בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>זמן שמירה נטו בשיא מרבי (מינימום)</td>
			<td>SD (%) זמן שמירה</td>
			<td>רדיוס הידרודינמי (nm)</td>
			<td>שחזור (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 6: סיכום זמני השמירה במקסימום השיא של UV-Vis בהתאמה, הרדיוס ההידרודינמי שחושב מכייל הגודל החיצוני (איור 2) וקצב ההחלמה של דגימת AuNP הלא ידועה המתקבלת מניתוח AF4-UV-vis.

Watch this Scientific Journal Video about Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension at JoVE.com

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי בשילוב עם זיהוי UV-vis לקביעת הגודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע.

שבר זרימה א-סימטרי שדה זרימה לשינוי גודל של חלקיקי זהב בהשעיה

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.1K Views.  Postnova Analytics GmbH. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשבר שדה זרימה-זרימה אסימטרי בשילוב עם זיהוי UV-vis לקביעת הגודל של מדגם חלקיקי זהב לא ידוע.

Video: Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

ייצור, תפעול ויזואליזציה זרימה במיקרופלואידיקה אקוסטית-נגדית Surface--מונע גל אקוסטי

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Engineering

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

ההדמיה confocal של רגיעה מרותקת ותערובות קולואיד פולימר מזרימים

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Chemistry

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics לסינתזה כימית וזמן נפתר מכניסטית לימודים

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

לימוד תהליכים דינמיים של אובייקטים בגודל ננו בנוזל באמצעות מיקרוסקופי אלקטרוני סריקת הילוכים

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

The Diffusion of Passive Tracers in Laminar Shear Flow

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of first injecting fluorescent dye directly into a pipe filled with distilled water and allowing it to diffuse across the cross-section of the pipe to obtain a uniformly distributed initial condition. Following this period, the laminar flow is activated with a programmable syringe pump to observe the competition of advection and diffusion of the tracer through the pipe. Asymmetries in the tracer distribution are studied and correlations between the pipe cross-section and the shape of the distribution is shown: thin channels (aspect ratio &#60;&#60; 1) produce tracers arriving with sharp fronts and tapering tails (front-loaded distributions), while thick channels (aspect ratio ~1) present the opposite behavior (back-loaded distributions). The experimental procedure is applied to capillary tubes of various geometries and is particularly relevant to microfluidic applications by dynamical similarity.

A protocol for the study of the diffusion of passive tracers in laminar pressure-driven flow is presented. The procedure is applicable to various capillary pipe geometries.

פעפוע של המשדרים פסיבי בזרימת הטיה למינריות

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

ניתוח מעקב חלקיקים של חלקיקי זהב במדיה מימית באמצעות השוואה בין מעבדות

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

סינתזת חלקיקי זהב

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Biochemistry

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Ultrafiltration זרימה משיק: שיטה &quot;ירוקה&quot; לבחירת הגודל והריכוז של חלקיקי כסף Colloidal

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...