עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית (BioMET); NIH (1U01HL1116321) ו -(1R01HL142290) ואיגוד הלב האמריקאי 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (בג"ץ).

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת מרילנד בולטימור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה פרוטוקולים.
1. הכנת הפתרונות
הערה: הכינו פתרונות מראש. שני סוגים של פתרונות בסיסיים משמשים בניסויים: (1) פתרונות מלוחים פיזיולוגיים (PSS) עבור superfusate אמבטיה ו (2) הפתרונות של טירודה עבור לומן perfusate. מבעבע מתמשך עם CO 2 ישצורך לשמור על ה- pH של PSS. הפתרון של Tyrode HEPES-אגירה משמש לומן במקום PSS כדי למנוע בועות הולך לתוך כלי, שכן בועות יפגעו בתאי האנדותל7 ולחסן את הזרימה.
<ol><li>פתרון PSS: ראה את הנוסחה וההרכב של פתרון PSS בטבלה 1. הפוך 10 L של Ca2 +ללא גלוקוז PSS מלאי פתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר. 1 שעה לפני כל הליך, להוציא 1 L של פתרון המניה בועה עם 5% CO2 (74% N2 ו 21% O2) כדי לשמור על ה- pH של הפתרון ב ~ 7.4. הוסף 1.8 גרם גלוקוז ו 1.8 מ"ל CaCl2 (1 M מלאי)8. הערה: הוסף Ca2+ רק לאחר מבעבע כאשר pH הוא ~ 7.4, אחרת, Ca2 + יהיה זירז.</li>
	<li>הפתרון של Tyrode: ראה את הנוסחה וההרכב של הפתרון של Tyrode בטבלה 1. לסנן את הפתרון (0.22 מיקרומטר) ומאוחסן ב 4 °C (69 °F) לשימוש עתידי9.</li>
	<li>הפתרון של Tyrode עם BDM (2,3-בוטנדיונה monoxime): להוסיף BDM כמעכב myofilament הפיך כדי למנוע התכווצות של myocytes10. לשקול 600 מ"ג BDM ולהוסיף 200 מ"ל של הפתרון של Tyrode. מערבבים את הפתרון עם BDM עד שהוא מומס לחלוטין. אין צורך בסינון נוסף.</li>
	<li>אחסן את הפתרון של Tyrode המכיל BDM ב 4 °C (60 °F) לשימוש עתידי.</li>
</ol>2. הכנה קאמרית
<ol><li>מעיל הן תא ניתוח תא ניסיוני מראש עם polydimethylsiloxane (PDMS) בעקבות ההוראות שסופקו על ידי היצרן.</li>
	<li>מלאו את תא הניתוק בתמיסה של Tyrode המכילה BDM.</li>
	<li>הפעל את הצ'ילר 1 שעה לפני ההליך. הגדר את הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת קנולה
<ol><li>הפעל את פולר המיקרופיפט. בחר את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>קח צינור זכוכית בורוסיליקט נקי (הקוטר החיצוני והפנימי של צינורות הזכוכית המשמשים היה 1.2 מ"מ ו 0.69 מ"מ בהתאמה).</li>
	<li>הכנס צינור זכוכית לתוך מלחציים מחורצים של פולטר סאטר פיפטה עם חוט חימום פלטינה בצורת U.</li>
	<li>הפעל את המושך כדי לייצר שתי קנולה, כל אחד עם קצה דק ארוך.</li>
	<li>חותכים את הקצה של כל קנולה באמצעות זוג דק של מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להפוך את הקוטר הסופי של הקצה סביב 100 כדי 150 מיקרומטר.</li>
	<li>אש ללטש את קצה הצינורית לחתוך מעט סביב הקצוות החדים.</li>
	<li>לכופף את הצינורית לאורך הפיר באמצעות חוט פלטינה (מחומם עם שליטה עדינה) ממוקם בצד של הפיר כ 2 מ"מ מקצה. הזווית של העיקול בקנולה צריכה להיות סביב 45 מעלות.</li>
	<li>הכנס את הקצה הפתוח של הצינורית למחזיק תא מיוגרף הלחץ והדק את המדידה. חבר מזרק 5 מ"ל מלא עם הפתרון של Tyrode לצד השני של המדידה. חברו את הצינורית למיקרו-מניפולטור המותקן בתא (ראו איור 1 ואיור 2).</li>
	<li>ממלאים את הצינור בתמיסה של Tyrode באמצעות המזרק (5 מ"ל), שוטפים אותו, את הצינור ואת המחבר של בועות אוויר.</li>
	<li>לפני פרוצדורת הצינור, מדדו את לחץ הזלוף בתוך הצינורית על פני טווח זרימה נתון (50 עד 300 μL/min, איור 3). עשה זאת רק כאשר נעשה שימוש בקנולה חדשה. הערה: לחץ הזלוף בתוך הצינורית פרופורציונלי לזרימה ומותאם ליניארי(איור 3).</li>
</ol>4. חילוץ לב העכבר
<ol><li>שים עכבר C57BL/6 (או מין, 8-16 שבועות) בתיבת ההרדמה המחוברת למיכלי isoflurane וחמצן.</li>
	<li>הפעל מיכל חמצן ולהתחיל את זרימת isoflurane. המתן ~ 5 דקות עד שהעכבר מורדם לחלוטין.</li>
	<li>לאחר הרדמה הוקמה, להוציא את העכבר מתוך תיבת הרדמה ולהזריק הפרין IP (לתוך חלל הצפק, 360 יחידות, 0.5 מ"ל / עכבר) כדי למנוע היווצרות קריש דם בכלי הדם. ואז להחזיר את העכבר לתיבת ההרדמה.</li>
	<li>10 דקות לאחר הפרין כבר מוזרק, להזיז את העכבר למיטה מחוממת בתנוחה סופית לייצב את כפותיו באמצעות סרט תיוג. שמור את העכבר תחת הרדמה מלאה עם isoflurane באמצעות חרוט האף.</li>
	<li>הרם את עור הבטן של העכבר מעל הסרעפת עם מלקחיים והשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך ולחשוף את הסרעפת.</li>
	<li>חותכים את הסרעפת ואת עצם החזה. פתח את החזה.</li>
	<li>לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה, חיתוך קרוב ככל האפשר לקיר בית החזה הגבי.</li>
	<li>מניחים את הלב לתוך הפתרון של Tyrode קר כקרח המכיל 30 מ"מ BDM.</li>
	<li>נקה את הלב כדי להסיר את רקמות החיבור כגון ריאות.</li>
	<li>מעבירים את הלב לתא הניתוק המצונן מראש, המלא בתמיסה של טיירוד המכילה 30 מ"מ BDM.</li>
</ol>5. הכנה וקנציה של עורק מחיצה
<ol><li>תדליק את משאבת הסרוו. הגדר את משאבת הסרוו למצב "זרימה". תן לו לרוץ במהירות גבוהה עד הצינור מלא עם הפתרון של Tyrode שישמש כדי לחלחל לומן כלי הדם. ודא שאין בועות בצינורות. אז תנמיך את המהירות.</li>
	<li>הצמד את הלב אל PDMS, הימנעות כל נזק לאזור האמצעי של הלב.</li>
	<li>הסר גם את האטריה הימנית וגם השמאלית. חותכים לפתוח את החדר הימני ולהסיר את הקיר הימני ללא חדרית באמצעות מיקרוסקופ מנתח.</li>
	<li>לחשוף ולזהות את עורק המחיצה. מניחים חוט ניילון (קוטר 30 מיקרומטר) מתחת לעורק המחיצה וקושרים קשר רופף לשימוש עתידי. הערה: ניתן לזהות בקלות את עורק המחיצה באמצעות מיקרוסקופ מנתח. עורק המחיצה הוא עורק ראשי על מחיצה שמקורו בעורק הכלילי הנכון ברוב המקרים.</li>
	<li>הסר את הקיר השמאלי ללא חדרים באמצעות מספריים עדינות.</li>
	<li>מעבירים את הכנת שריר הפפילרי לתא הניסוי שבו הוצבה הצינורית. התא מלא בתמיסה של טיירוד המכילה BDM. החלק התחתון של תא זה מצופה בשכבה דקה (~ 2 מ"מ) של PDMS.</li>
	<li>להתאים את המיקום של הצינורית (באמצעות micromanipulator) כדי לאפשר קנולציה של עורק המחיצה. הדק את הקשר.</li>
	<li>לאבטח את שריר הפפילרי באמצעות סיכות קטנות לרצפת התא, כך המטרה מיקרוסקופ יש תצוגה ברורה של כלי הדם. שימו לב לזווית ולמיקום הצינורית והבטיחו שקצה הצינורית מקביל לקיר העורקים.</li>
	<li>בדיקת קנולציה על ידי גירוש הדרגתי של הפתרון מהמזרק דרך הצינורית. אם כל האלמנטים לתפקד כראוי, שאריות דם בשריר הפפילרי ייצא הרקמה בתחילת תהליך זה ורק הפתרון של Tyrode ייראה מאוחר יותר.</li>
</ol>6. ייצוב ההכנה
<ol><li>הפעל את המשאבה peristaltic שיספק את פתרון superfusion. ואז כל הזמן superfuse ההכנה באמבטיה עם PSS גזים מראש בקצב של 3-4 מ"ל / דקה.</li>
	<li>הפעל את בקר הטמפרטורה עבור פתרון superfusion. להתאים את הטמפרטורה של superfusate האמבטיה ~ 35-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חבר את הצינורית למשאבת הסרוו. קרא את הלחץ המוצג על בקר סרוו הלחץ.</li>
	<li>לפקח על הזרימה והלחץ. הזרימה (μL/min) ולחץ זלוף העורקים (מ"מ ח"ג) הם דיגיטציה באמצעות דיגיטייזר ומתועדים באמצעות תוכנה משויכת (איור 2).</li>
	<li>להתאים את הזרימה כדי להגדיר את הלחץ ~ 10 מ"מ ש"ג ולתת לו לרוץ במשך ~ 10 דקות.</li>
	<li>להגביר את זרימת הפתרון הזוהר כדי להפוך את הלחץ של העורק ~ 60 מ"מ.ג. השג את לחץ הזלוף הסופי של העורק עצמו על ידי חיסור טיפת הלחץ של הצינורית (איור 3). הערה: אם מצב "לחץ" על בקר סרוו לחץ נבחר, הלחץ הזוהר מוגדר ~ 60 מ"מ ח"ג לניסויים אלה. לאחר מכן נטר את שינוי הזרימה.</li>
	<li>תן לדגימה לייצב ~ 30-60 דקות על ידי ניטור רמות הזרימה ו / או הלחץ. עלייה הדרגתית של לחץ עורקי נצפתה בדרך כלל בתחילת זלוף לאחר קנולציה. מדינה יציבה חדשה תקום מעצמה ב-30 דקות(איור 4).</li>
	<li>ליזום ניסוי לאחר לחץ זלוף מיוצב (בזרימה מתמדת).</li>
</ol>7. טעינת ההכנה עם אגלוטינין נבט חיטה מתויג פלואורסצנטי (WGA)
<ol><li>הכן את הפתרון של Tyrode המכיל אלקסה-פלואור-488 מצומד WGA על ידי הוספת 100 מיקרוגרם של WGA מצומד לתוך 5 מ"ל של הפתרון של Tyrode.</li>
	<li>בזהירות לעבור perfusate מן הפתרון של Tyrode נורמלי אחד המכיל WGA מתויג פלואורסצנטי. חשוב להחליף בזהירות את perfusate, כך בועות לא הציגו.</li>
	<li>לאחר ~ 30 דקות של זלוף WGA או כאשר פתרון WGA עומד להיגמר, לשנות את perfusate בחזרה לפתרון הרגיל של Tyrode.</li>
</ol>8. הדמיה קונפוקלית של עורקים ונימים
<ol><li>הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית של דיסק Nipkow.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ כדי לאתר את עורק המחיצה באמצעות מטרת הספק נמוך (4x) במצב אור משודר. הערה: עורק Septal יכול להיות ממוקם על ידי ביצוע המיקום של הצינורית.</li>
	<li>התחל הדמיה confocal עם confocal דיסק מסתובב ובחר לייזר עירור 488 ננומטר, הגדלה אובייקטיבית 40x ולהתאים את עוצמת הלייזר ואת קצב הדגימה (10 - 500 ms לתמונה).</li>
	<li>הגדר עמדות דימות עליונות ותחתונות עבור המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להגדיר את טווח ההדמיה והזן את הפרמטרים עבור הדמיית מחסנית z.</li>
	<li>הגדר את גודל השלב כפי שהומלץ עבור המערכת הנמצאת בשימוש או הגדר את גודל השלב כרצונך.</li>
	<li>בחר בהגדרות של הגדרת מחסנית z ו/או הגדרות סידרת הזמן.</li>
	<li>בחר או הגדר תיקיה חדשה לאחסון התמונה החדשה.</li>
	<li>לחץ על "הפעל" כדי להתחיל להקליט הדמיה לניתוח עתידי (איור 5).</li>
</ol>9. ניסוי vasodilator לדוגמה: vasodilation הנגרמת על ידי פינצ'ידיל (וידאו 1).
<ol><li>הכן פתרון מלאי פינצ'ידיל (100 מ"מ ב- DMSO) ומאוחסן ב- 4 °C (60 °F).</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית pinacidil כדי להפוך את הריכוז הסופי של pinacidil 100 μM.</li>
	<li>תמונה שריר הפפילרי בהגדלה נמוכה (4x המטרה) כדי לכלול את עורק המחיצה ואת עורקי הענף.</li>
	<li>החלף פתרון לומינלי לפינצ'ידיל המכיל פתרון.</li>
</ol>10. ניסויים לדוגמה לבקרת זרימת דם: לחץ זלוף עורקי הנגרם על ידי vasoconstrictor עולה בזרימה מתמדת (איור 6)
<ol><li>הכינו פתרון מלאי אנדותלין-1 (ET-1) (10 מיקרומטר) ומאוחסנים ב-20°C(20°C).</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית ET-1 (10 מיקרומטר) כדי להפוך את הריכוז הסופי של ET-1 10 nM.</li>
	<li>להקליט את הלחץ הזוהר עם זרימה מתמדת תמונה שריר הפפילרי.</li>
	<li>החלף פתרון לומינלי לפתרון המכיל ET-1.</li>
</ol>11. תמונות לדוגמה של נימי עם פריצילים (איור 7)
<ol><li>להקריב עכבר מהונדס NG2DsRedBAC כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול זה.</li>
	<li>לחלץ את הלב, cannulate את עורק המחיצה ולטעון את המדגם עם Alexa-Fluor-488 מצומד WGA בעקבות פרוטוקולים 5-7.</li>
	<li>תמונה שריר הפפילרי ב 488 ננומטר ו 560 ננומטר עירור, ו 510-525 ננומטר, 575-625 ננומטר פליטה באמצעות confocal. לחץ העורקים יהיה סביב 40 מ"מ.ג.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

בעבודה הנוכחית, הצגנו שיטת אקס ויו פשוטה להפליא אך מעשית מאוד לחקר המיקרו-סירקולציה כלילית בלב בתנאים פיזיולוגיים. שיטה זו שונתה מחקירות מכניות באמצעות חולדות2. התוספת המאתגרת הייתה טכנולוגיית ההדמיה במהירות גבוהה וברזולוציה אופטית גבוהה. לכן, הצלחנו לנצל את מערכות ההדמיה ה?...

תקנה מתאימה לזרימת לחץ כלילית מבטיחה אספקת דם מספקת ללב כדי לענות על דרישותיו המטבוליות1. עם זאת, רק לאחרונה התברר כיצד זרימת הלחץ הכלילי מוסדר באופן דינמי בלב, למרות מחקרים מקיפים שבוצעו ב vivo ו במבחנה בעשורים האחרונים. אחת הסיבות לכך היא הקושי להקים מודל עבודה פיזיולוגי למחקרים כאלה עקב פעימות הלב המתמידות. ללא קשר, הוקמו מגוון שיטות לתצפית על כלי הדם הכליליים ברקמות או בבעלי חיים חיים, אך אף אחת משיטות אלה לא הצליחה להשיג מיקוד קבוע /יציב ומדידות הלחץ, הזרימה וקוטר המיקרו-וסקולרי בו זמנית2,3. ההדמיה הישירה של כלי הדם העורקיים הכליליים בלב פועם הוצגה לפני עשרות שנים4,3, אבל מדידות הקוטר בכלי קטן היה מאתגר ואת הפונקציות הספציפיות של סוגי תאים מיוחדים רבים הקשורים microcirculation היה מרגיז באותה מידה. אפילו השיטה סטרובוסקופית ומערכת אובייקטיבית צפה לא יכול לספק את המידע לעיל בו זמנית5. עם זאת, כמות משמעותית של מידע בעל ערך הושגה באמצעות הטכנולוגיות הנ"ל, אשר עזרו לנו להבין יותר על הרגולציה של זרימת דם כלילית6. השיטה שאנו מתארים במאמר זה תסייע לאחת לחקור ולהבין בפירוט כיצד רכיבים של עורקים כליליים, העורקים והמיקרו-וסקולטורה מגיבים באופן שונה לגירויים ולדרישות מטבוליות.
מודל העבודה שהקמנו כדי להמשיך במחקרים אלה נבנה על העבודה הקודמת של ווסטרהוף ואח'2. בעקבות קנולציה של עורק המחיצה של לב העכבר, תמיסת מלח פיזיולוגית שימשה כדי להחדיר את העורק כדי לשמור על myocytes ורכיבים אחרים של רקמת הלב ניזונו. לחץ הזלוף העורקי, הזרימה וקוטר כלי הדם היו במעקב בין פונקציות פיזיולוגיות אחרות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים מתאימים. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין את מיטת המיקרו-כלילית תחת לחץ פיזיולוגי ברקמה חיה וללמוד לראשונה את המנגנונים התאיים שבבסיס ויסות המיקרו-סירקולציה.

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl2 solution</td><td>MilliporeSigma, USA</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 solution</td><td>MilliporeSigma, USA</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope software</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chiller/water incubator</td><td>FisherScientific, USA</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Nikon Instruments, USA</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Custom glass tubing</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>MilliporeSigma, USA</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Salt</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Inline solution Heater</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, Idaho, USA</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette/cannula holder</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Nylon thread for tying blood vessels</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Servo Pump</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

טון עורקי כלילית יחד עם פתיחה או סגירה של נימים במידה רבה לקבוע את זרימת הדם cardiomyocytes בלחץ זלוף מתמיד. עם זאת, קשה לעקוב אחר השינויים הדינמיים של העורקים הכליליים ונימים בלב כולו, בעיקר בשל התנועה שלה פועם ללא הפסקה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת ניטור של קצב זלוף העורקים, לחץ ושינויים בקוטר של העורקים ונימים בשרירי הפפילרי הימניים של העכבר. עורק מחיצת העכבר הוא cannulated ו perfused בזרימה מתמדת או לחץ עם האחר נמדד באופן דינמי. לאחר זלוף עם לקטין שכותרתו פלואורסצנטית (למשל, אלקסה פלואור-488 או -633 שכותרתו חיטה-נבט Agglutinin, WGA), העורקים ונימים (וכלי דם אחרים) בשריר פפילרי החדר הימני מחיצה יכול להיות בתמונה בקלות. לאחר מכן ניתן למדוד את השינויים בקוטר כלי השיט בנוכחות או בהיעדר התכווצויות לב. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית באו לידי ביטוי, ניתן היה לפקח על תכונות ספציפיות. לדוגמה, פריטיטים הוצגו בלבבות עכברים שהביעו NG2-DsRed. שיטה זו סיפקה פלטפורמה שימושית כדי ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות של pericytes נימי בלב. הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של ריאגנטים על זרימת הדם בלב על ידי מדידת קוטר כלי הדם / נימי ואת הלחץ הזוהר העורקי בו זמנית. הכנה זו, בשילוב עם מערכת הדמיה אופטית מתקדמת, מאפשרת לחקור את זרימת הדם ואת שליטתה ברמה התאית והמולקולרית בלב בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי הוא perfused לומן כלי דם (כאן WGA מצומד עם Alexa Fluor-488), ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים כפי שמוצג באיור 5 (פאנל שמאלי) באמצעות מיקרוסקופ confocal במהירות גבוהה. הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של נימי בפירוט(איור 5, לוח ימני). מאז המערכת בלחץ תומך ניטור מת?...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart at JoVE.com

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

5.3K Views.  University of Maryland School of Medicine. מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

Video: Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengineering

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for imaging vasculature, few are able to visualize the vascular network as a whole while extending to a resolution that includes the smaller vessels1,2. Additionally, many vascular casting techniques destroy the surrounding tissue, preventing further analysis of the sample3-5. One method which circumvents these issues is micro-Computed Tomography (&mu;CT). &mu;CT imaging can scan at resolutions &lt;10 microns, is capable of producing 3D reconstructions of the vascular network, and leaves the tissue intact for subsequent analysis (e.g., histology and morphometry)6-11. However, imaging vessels by ex vivo &mu;CT methods requires that the vessels be filled with a radiopaque compound. As such, the accurate representation of vasculature produced by &mu;CT imaging is contingent upon reliable and complete filling of the vessels. In this protocol, we describe a technique for filling mouse coronary vessels in preparation for &mu;CT imaging.
Two predominate techniques exist for filling the coronary vasculature: in vivo via cannulation and retrograde perfusion of the aorta (or a branch off the aortic arch) 12-14, or ex vivo via a Langendorff perfusion system 15-17. Here we describe an in vivo aortic cannulation method which has been specifically designed to ensure filling of all vessels. We use a low viscosity radiopaque compound called Microfil which can perfuse through the smallest vessels to fill all the capillaries, as well as both the arterial and venous sides of the vascular network. Vessels are perfused with buffer using a pressurized perfusion system, and then filled with Microfil. To ensure that Microfil fills the small higher resistance vessels, we ligate the large branches emanating from the aorta, which diverts the Microfil into the coronaries. Once filling is complete, to prevent the elastic nature of cardiac tissue from squeezing Microfil out of some vessels, we ligate accessible major vascular exit points immediately after filling. Therefore, our technique is optimized for complete filling and maximum retention of the filling agent, enabling visualization of the complete coronary vascular network &#x2013; arteries, capillaries, and veins alike.

Visualization of the coronary vessels is critical to advancing our understanding of cardiovascular diseases. Here we describe a method for perfusing murine coronary vasculature with a radiopaque silicone rubber (Microfil), in preparation for micro-Computed Tomography (&mu;CT) imaging.

זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Murine Echocardiography of Left Atrium, Aorta, and Pulmonary Artery

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic pressure through echocardiography, as well as to obtain measurements of the Aorta and PA diameter in mice.
Mice older than 10 d of age can be analyzed using the present technique. The technique is composed of 3 main steps: set-up, image acquisition, and image analysis. The set-up step consists of getting the mouse anesthetized with 1% isoflurane, shaving it, and taping it in a supine position to a heated EKG board where the image acquisition will take place. The image acquisition step consists of learning to identify the cardiac structures and obtaining all the required images with its correspondent probe and axis in order to be able to calculate volumes and diameters. The image analysis step consists of measuring the previously acquired images with the aid of computer software.
Advantages of the proposed technique include a fast (15 min) procedure that would allow the researcher to evaluate interventions in a non-invasive, non-terminal approach and therefore follow the same mouse over time; each mouse can be used as its own control. This fact plus having the same operator perform all the acquisition and analysis for the entire experiment minimizes the limitation of operator-dependency. The present methodology is useful for mouse researchers in cardiovascular and pulmonary medicine.

The following protocol describes the methodology for the acquisition and analysis of echocardiographic images used to obtain the Left Atrial Volume (LAV), Aorta (Ao) diameter, and Pulmonary Artery (PA) diameter in mice. This technique is a non-invasive, non-terminal procedure that allows assessment of the cardiopulmonary function.

אקו Murine של השמאל אטריום, אבי העורקים, ו עורק הריאה

The present methodology teaches the investigator how to measure and use the LAV as a surrogate of chronic elevations in Left Ventricular diastolic ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations result in pathology, and how myocardial diseases may be treated. Cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) has become an indispensable tool for a comprehensive in vivo assessment of cardiac anatomy and function. This protocol shows detailed measurements of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces using 7-Tesla CMR. First, animal preparation and positioning in the scanner are demonstrated. Survey scans are performed for planning imaging slices in various short- and long-axis views. A series of prospective ECG-triggered short-axis (SA) movies (or CINE images) are acquired covering the heart from apex to base, capturing end-systolic and end-diastolic phases. Subsequently, single-slice, retrospectively gated CINE images are acquired in a midventricular SA view, and in 2-, 3-, and 4-chamber views, to be reconstructed into high-temporal resolution CINE images using custom-built and open-source software. CINE images are subsequently analyzed using dedicated CMR image analysis software.
Delineating endomyocardial and epicardial borders in SA end-systolic and end-diastolic CINE images allows for the calculation of end-systolic and end-diastolic volumes, ejection fraction, and cardiac output. The midventricular SA CINE images are delineated for all cardiac time frames to extract a detailed volume-time curve. Its time derivative allows for the calculation of the diastolic function as the ratio of the early filling and atrial contraction waves. Finally, left ventricular endocardial walls in the 2-, 3-, and 4-chamber views are delineated using feature-tracking, from which longitudinal myocardial strain parameters and left ventricular hemodynamic forces are calculated. In conclusion, this protocol provides detailed in vivo quantification of the mouse cardiac parameters, which can be used to study temporal alterations in cardiac function in various mouse models of heart disease.

This study describes a comprehensive cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) protocol to quantify the left ventricular functional parameters of the mouse heart. The protocol describes the acquisition, post-processing, and analysis of the CMR images as well as assessment of different cardiac functional parameters.

כימות של תפקוד החדר השמאלי של לב העכבר, זן שריר הלב וכוחות המודינמיים על ידי הדמיית תהודה מגנטית לב וכלי דם

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...

מיקרוסקופ יריעות אור וניקוי רקמות להדמיית לב מקיפה

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights into fundamental cardiac physiology and pathologic responses. We hereby delve into the development and implementation of the LSM technique to elucidate the micro-architecture of the heart in mouse models. The methodology integrates a customized LSM system with tissue clearing techniques, mitigating light scattering within cardiac tissues for volumetric imaging. The combination of conventional LSM with image stitching and multiview deconvolution approaches allows for the capture of the entire heart. To address the inherent trade-off between axial resolution and field of view (FOV), we further introduce an axially swept light-sheet microscopy (ASLM) method to minimize out-of-focus light and uniformly illuminate the heart across the propagation direction. In the meanwhile, tissue clearing methods such as iDISCO enhance light penetration, facilitating the visualization of deep structures and ensuring a comprehensive examination of the myocardium throughout the entire heart. The combination of the proposed LSM and tissue clearing methods presents a promising platform for researchers in resolving cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

מחבר זרקור: הדמיית גיליון אור מותאמת אישית לחקר מבנים שריר הלב בלבבות מכרסמים

The protocol utilizes advanced light-sheet microscopy along with adapted tissue clearing methods to investigate intricate cardiac structures in rodent hearts, holding great potential for the understanding of cardiac morphogenesis and remodeling.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

אקו Murine של השמאל אטריום, אבי העורקים, ו עורק הריאה

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

כימות של תפקוד החדר השמאלי של לב העכבר, זן שריר הלב וכוחות המודינמיים על ידי הדמיית תהודה מגנטית לב וכלי דם

ניתוח כמותי מיקרו-CT Aortopathy במודל של עכברים של β-aminopropionitrile-induced מפרצת אבי העורקים, דיסקציה

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים