באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים להתייחס לשאלות מפתח לגבי האופן שבו מיקרואורגניזמים מתאספים ומקיימים אינטראקציה בפילוספירה. יש לו יתרון נוסף כי באמצעות תמצית ירקות סטריליים, אנחנו יכולים לקשר את המבנה של קהילות כדור phyllo לתפקוד שלהם במהלך תסיסה צמחית. טכניקות אלה מאפשרות למדענים לבדוק כיצד מיקרואורגניזמים מתקשרים בתחום פילו ולאחר מכן לעקוב אחר האופן שבו קהילות כדור פילו אלה יכולות להשפיע על התסיסה.
כדי לחשוף את זרעי הכרוב, להתחיל על ידי הצבת 100 זרעים בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול לצינור ומערבולת אותו במשך חמש דקות. ואז להשתמש פיפטה כדי להשליך את האתנול.
מוסיפים מיליליטר אחד של 50% אקונומיקה ומערבולת הצינור במשך חמש דקות, ואז להשליך את האקונומיקה. לשטוף את הזרעים ארבע פעמים, על ידי הוספת מיליליטר אחד של מים deionized autoclaved מערבולת הצינור, ולאחר מכן להשליך את המים. לאחר שטיפה האחרונה, להשרות את הזרעים במים מעוקרים deionized במשך שעתיים עד שמונה שעות כדי לרכך את מעיל הזרע לפני השתיל.
לשקול 10 גרם של חימר סידן נקי לתוך צינור זכוכית 15 על ידי 2.5 ס"מ. מוסיפים כתשעה מיליליטר של מרק MS מוכן לכל צינור כדי לכסות את החימר סידן. מכסים באופן רופף את צינורות הזכוכית עם 22 מילימטר דו-כיוון כובעי מבחנה.
אוטוקלאב הצינורות ב 121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בעת הסרת הצינורות מן autoclave, לדחוף את הכובעים על צינורות הזכוכית כדי לאטום אותם, ולאחר מכן לקרר את הצינורות לטמפרטורת החדר לפני השימוש. כאשר הצינורות התקררו, השתמשו במטחים ארוכים במיוחד כדי למקם בעדינות זרע כרוב סטרילי אחד במרכז כל צינור.
תחרה את הצינורות במגש שבעה כיוון והמקום את המגש תחת מתלים אור עם מחזור אור 16 שעות ב 24 מעלות צלזיוס. הזרעים יפתחו את העלה האמיתי הראשון שלהם לאחר חמישה ימים, שהוא עלה כלי הדם הראשון לאחר הקוטילדונים נוצרו. יש לו קצה מקומט והוא מכוסה טריקומבות.
כדי לבדוק את הכרוב ללא חיידקים לסטריליות, אוחזים בעדינות בבסיס הצמח במטחים מעוקרים ושולף אותו החוצה. לפני הסרת הכרוב באופן מלא מהצינור, בזהירות לחתוך את השורשים עם מספריים ניתוח מעוקר. לאחר מכן, לדחוס את עלי הכרוב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
הוסיפו 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור מיקרו צנטריפוגה ולהשתמש עלה מיקרו סטרילי כדי הומוגניזציה של הכרוב. להב 100 מיקרוליטרים של הכרוב הומוגניים על צלחות אגר, ומוודאים להשתמש בקצה פיפטה פתח רחב. כדי להפוך את מניות גליצרול של זנים מאמץ, בעדינות פסים מושבות בודדות על שתיים או שלוש צלחות חדשות של אותה מדיה.
משורים את המושבות במשך יומיים עד חמישה ימים, ואז מגרדים אותן מהצלחות לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 15 מיליליטר של 15% גליצרול. מערבולת הצינור ביסודיות לערבב. Aliquot מיליליטר אחד של מלאי גליצרול מעורב לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה ולאחסן אותו 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש יחד עם הנותרים 14 מיליליטר של מלאי גליצרול.
שבוע לפני השימוש, להפשיר את aliquot מיליליטר אחד על קרח ומ מניחים אותו בכמה דילולים שונים כדי לקבוע את הריכוז של מלאי החיסון. כאשר מוכן לחסן את הכרוב, להפשיר את מלאי גליצרול על קרח לדלל אותו לריכוז הרצוי. הוסיפו 10 מיליליטר מהמלאי המדולל לבקבוק המשאבה הסטרילית והזרימה חמישה תרסיסים לתוך מקור איסוף פסולת גדול.
מוציאים את המכסה מצינור הכרוב ומטה את הכרוב לכיוון בקבוק הריסוס. לרסס כל כרוב עם שלוש משאבות של פתרון החיסון, ולאחר מכן לקצור תת קבוצה של כרוב כדי להעריך את ריכוז חיסון קלט בפועל. כדי לקצור את הכרוב, הסר אותו מהצינור עם מדפים מעוקרים.
חותכים את השורשים עם מספריים ניתוח סטריליים בזהירות למקם אותו צינור מיקרו סטרילי שקל מראש צנטריפוגה. רשום את משקל הכרוב לחישובים עתידיים. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של PBS לכל צינור עם הכרוב וטוחנים אותו 30 פעמים עם עלה מיקרו, ואז צלחת הומוגנט כרוב באמצעות טיפים רחבים פיפט פתח.
מוציאים ומשליכים את העלים החיצוניים ביותר של הכרוב וקוצצים את כל הכרוב שנותר כדי להתאים לבלנדר. מערבבים אותו לעיסה עדין ומשקללים את הכרוב הומוגני. מוסיפים שני מיליליטר של מים מזוקקים לגרם כרוב.
לאחר מכן לסנן את תרחיף הכרוב דרך שתי שכבות של מסנני קפה סל. מחלקים את תרחיף לתוך צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה אותו ב 20, 000 פעמים G במשך 20 דקות או עד חלקיקים גדולים להתיישב מחוץ לפתרון. הסר את supernatant, דואג לא להפריע פסולת כרוב גלולה.
כדי לשחזר את תנאי התסיסה עם ריכוזי מלח סטנדרטיים, להוסיף 2% משקל לנפח נתרן כלורי לתמצית. Bilder תמצית הירקות עם מסנן מיקרומטר 0.2 מחובר ואקום, לחלק אותו לתוך צינורות סטריליים להקפיא אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. שיטת עיקור הזרעים נבדקה עם כמה כרוב נאפה וכולנו הפגינו שיעורי צמיחה דומים.
עם זאת, מינים אחרים של brassica נתן הצלחה מוגבלת כי הצמחים היו גם שיעורי נביטה נמוכים לאחר עיקור או הגבעול התארך במהירות כדי להפוך צמח לא בריא. מבודדים מיקרוביאליים היו מחוסנים או כמו זן יחיד מבודד או בשילוב עם בידוד אחר. בסך הכל נבדקו 15 כרובים ללא נבטים לכל טיפול ונקצרו באופן מיידי, בארבעה ימים או ב-10 ימים לאחר החיסון.
המבודדים הדגימו צמיחה מהירה בפילוספירה של כרוב נאפה. שני שמרים ושלושה חיידקים היו מחוסנים לשלושה סוגים שונים של תמצית ירקות סטריליים או SVE עשוי כרוב אדום, ירוק נאפה. הצמיחה של החיסון נרשמה במשך 14 ימים על ידי ציפוי נקודת חמישה microliters של כל טיפול על צלחות אגר MRS או YPD.
מדידות של pH לאורך כל התסיסה הראו כי חיידקי חומצה לקטית היו מסוגלים חומציות SVE לרמות מתחת pH ארבע, המציין תסיסה כי הוא בטוח לצריכה. שיטות אלה יישמו במיוחד על מיקרוביום הכרוב אבל יכול להיות שימושי במערכות צמחיות אחרות. זה יכול להיות מאתגר לשמור על המערכת סטרילית, פרוטוקולי המתאר שלנו מפורטים, אבל מצאנו שכל צעד חשוב.
