הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק

נגיף אגם אמנון הוא וירוס מתפתח ופתוגנים מדבקים, הגורמים לתמותה גבוהה בא אמנון והמינים ההיברידיים שלו. כמו אמנון הוא מקור החלבון העיקרי עבור מדינות מתפתחות רבות, זיהום הנגיף החדש יש השפעה רבה על חקלאות ימית אמנון, וגם מאיים על ביטחון המזון העולמי. פיתוח שיטה מהירה, מדויקת ורגישה לגילוי הנגיף ברקמת הדג, תסייע לבקרת המחלה ותצמצם את השפעת הנגיף.

בסרטון זה, אנו נראה את ההגברה isothermal מתווך לולאת שעתוק הפוך, או RT-LAMP בדיקה, לגילוי מהיר של וירוס אגם אמנון בדגימות דגים. חלק שני, חילוץ רנ"א. ראשית, להוסיף 3250 מיליגרם של רקמת הכבד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר, המכיל 600 עד 1000 מיקרוליטר חומצה guanidinium-פנול בסיס רגנט, וטחון עד הומוגנית.

צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות, ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש. מוסיפים נפח שווה של 95% אתנול לצינור, ומערבבים היטב. העבר את הפתרון לתוך עמוד ספין, ממוקם בצינור איסוף, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות.

השלך את הזרימה והעבר את העמודה לצינור איסוף חדש. הוסף 400 microliters של RNA PreWash לתוך העמודה, צנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך 30 שניות. השלך את הזרימה דרך, וחזור על שלב זה.

הוסף מאגר שטיפת RNA 700 מיקרוליטר לתוך העמודה, וצנטריפוגה ב 10, 000 RCF במשך שתי דקות. לאחר מכן, להעביר את העמוד לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר. לבסוף, החלק את ה-RNA למטריצת העמודים עם מים נטולי 100 מיקרוליטר, נטולי גרעין וצנטריפוגה ב- 10,000 RCF למשך 30 שניות.

חלק שלישי, עיצוב פריימר. PrimerExplorer גרסה 4 הוא כלי הביואינפורמטיקה הנפוץ ביותר לעיצוב מנורה יעילה, או פריימרים RT-LAMP, שבו מדריכים טובים עבור התוכנה זמינים באתר האינטרנט שלהם. כאן, ארבעה פריימרים ספציפיים, המורכבים משני פריימרים פנימיים ושני פריימרים חיצוניים, תוכננו לזהות שישה אזורים נפרדים בקטע 3 של TiLV, שמקורם בתאילנד.

לאחר הכניסה לאתר האינטרנט, שבו הקישור מוצג בסרטון, לחץ על PrimerExplorer V4. בחר את הקובץ המכיל את הרצף של קטע 3 של TiLV, בפורמט FASTA, מאוחזר ממספר GenBank לגשת, KX631923, או tilapia אגם וירוס TV1 קטע 3, ולאחר מכן לחץ על לחצן עיצוב פריימר. לאחר לחיצה על לחצן צור, התוכנה תעבד, והתוצאות יופיעו. לאחר אופטימיזציה של הרצפים עבור הגברה LAMP, בסך הכל, זוג אחד של פריימרים חיצוניים, ושני זוגות של פריימרים פנימיים, נבחרו למחקר זה, כדי לזהות את הזיהום TiLV.

סט זה של פריימרים מוצגים כאן. חלק רביעי, הדגמה של RT-LAMP. התמהיל הראשי עבור RT-LAMP ספציפי עבור וירוס אגם אמנון, כולל את הכימיקלים הבאים.

הכינו תערובת אב באמצעות הכימיקלים המוצגים בטבלה. לוותר על 22 מיקרוליטרים של תערובת אב לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של תבנית RNA לתוך צינור התגובה.

לשליטה שלילית, יש להשתמש במים מזוקקים במקום בחומרי רנ"א, ולערבב היטב. הדגירה את התגובות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, ואחריו 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, השינויים הקלורימטריים נצפו חזותית על ידי עיניים עירומות.

במידת הצורך, אנו יכולים לאשר את תוצאות הבדיקה של RT-LAMP, על ידי ביצוע אלקטרופורזה ג'ל על 1.5% ג'ל אגרוז, פועל עם קבוע 100 וולט, במשך 40 דקות, לפיה סולם DNA בגודל מולקולרי של קילו-באז נטען יחד כסמן כדי לקבוע את גודל השבר. חלק חמישי, תוצאות מייצגות ופרשנות. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, תגובת פלואורסצנטיות התבואה המצביעה על הגברה חיובית של TiLV ברקמות דגים, נצפו כמובן בדגימות נגועות תחת אור UV באורך גל של 365 ננומטר, בעוד אלה של שליטה שלילית היה פתרון ברור וחסר צבע מעט.

בהתאמה, ההגברה של מוצרי RT-LAMP אושרה על אלקטרופורזה ג'ל agarose, מראה בגדלים שונים של הגברות מרובות של חזרות DNA הפוכות, יצירת מבנים לולאת גזע תחת מנורת UV בדגימות נגועות TiLV, ואילו לא להקות הוצגו בארות של הבקרה השלילית, שם התוצאות היו בהתאם לאלה של ASSAY RT-LAMP. לכן, כדי להפחית את התפשטות וירוס אגם אמנון, סינון מיידי של דגים נגועים אלה, בשיטת אבחון יעילה, הוא אחד המפתחות החשובים. לכן, הבדיקה RT-LAMP שפותחה לאחרונה צריכה להציע כלי אבחון מהיר ורגיש כדי להיות מיושם בתהליך של אמצעי אבטחה ביולוגית.

ניתן להשתמש בהגם במעבדה, או במתקנים באתר. אנו מקווים כי השיטה תיושם כדי לסנן אוכלוסיית דגים נגועים שיכולה להוביל להפחתת התפשטות נגיף אגם אמנון.