מישן קשירה קרבה מאפשר למשתמשים לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון במקום, חושף דפוסים מרחביים ותזמניים של האינטראקציות. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חשובות על רגולציה של פיתוח C.elegans. טכניקה זו מציעה רגישות דומה לגילוי אינטראקציות חלבון-חלבון ללא המורכבות של טכניקות אחרות, כגון FRET ו- BiFC.
אנשים שמעולם לא לנתח תולעים כדי לשחרר את הקניונים עשויים להיאבק עם צעד זה. תרגלו לנתח תולעים, ולהשתמש בהן לשפעת חיסונית כדי לשכלל את טכניקות הטיפול והניתוח לפני שתעבור ל-PLA. כדי להתחיל, לבחור 30 עד 40 תולעים בוגרות צעירות לתוך צלחת זכוכית שעון המכיל 500 microliters של 1x M9 ו levamisole.
לאחר איסוף התולעים, להסיר בזהירות להשליך את רוב התקשורת כדי להסיר חיידקים המועברים יחד עם התולעים. מוסיפים 500 מיקרוליטר טריים של 1x M9 ו levamisole, ולהשתמש פיפטה בעדינות לצייר ולחלק את התקשורת כדי לשטוף את התולעים. הסר ומחק בזהירות את רוב המדיה.
חזור על הכביסה פעמיים עד שלוש פעמים. לאחר הכביסה, להשאיר את התולעים על 100 microliters של מדיה במשך לא יותר משמונה דקות. בעזרת זכוכית או פיפטה פוליאתילן, מעבירים את התולעים לשקופית מיקרוסקופ של 25 מילימטר על 75 מילימטרים מצופה 001%poly-L-lysine.
הסר את המדיה העודפת כך שכ- 15 מיקרוליטרים של מדיה יישארו בשקופית. הסרת מאגר עודף היא קריטית כדי להבטיח כי תולעים ו gonads נותקו יהיה לדבוק בשקופית. תחת מיקרוסקופ לנתח, עם שני 26 1/2-מד מחטים, מניחים מחט אחת על השני, כך הקצוות יוצרים זוג מספריים.
באמצעות מחטים מכוונות בצורה זו, לחתוך את התולעים מאחורי הלוע כדי לשחרר את הנבטים. לנתח את כל התולעים בתוך חמש דקות. לאחר כל התולעים לנתח, בעדינות למקם כיסוי 22 מילימטר על ידי 40 מילימטר מעל השקופית, כך שהוא ניצב לשקופית.
הקצוות של המכסה צריכים להיתלות מחוץ לשקופית. להקפיא את השקופיות על בלוק אלומיניום מקורר מראש נשמר על קרח יבש לפחות 20 דקות. מניחים בעדינות עיפרון מצונן על גבי כיסוי כדי למנוע את כיסוי להשתחרר עקב הרחבת קרח.
כאשר מוכן קיבעון, להעיף את כיסויים עם עיפרון, ומיד לטבול את השקופית לתוך צנצנת המכילה מתנול טרי, קר כקרח במשך דקה אחת. לאחר מכן יש לנגב בעדינות את קצות השקופית המקיפה את הדגימה, ולהחיל 150 מיקרוליטרים של תיקון פורמלדהיד בטמפרטורת החדר כדי לתקן במשך חמש דקות. גע במגלשה למגבת נייר בזווית מאונך של 90 מעלות כדי לאפשר לתיקון לברוח מהמגלשה ולספוג לתוך מגבת הנייר.
חסום את השקופיות פעמיים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בצנצנת קופלין עם 50 מיליליטר של PBT / BSA. לאחר מכן חסום את השקופיות באמצעות פתרון PBT/BSA המכיל סרום עיזים רגיל של 10%. נגב בעדינות את הקצוות המקיפים את השקופית והחל 100 מיקרוליטרים של הפתרון על כל שקופית.
ובעדינות להתסיס את השקופית כדי לעזור להפיץ את הפתרון. דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח. מניחים את השקופית על מגבת נייר כדי לאפשר לפתרון לברוח מהשקופית, ומנגבים בעדינות את הקצוות.
כדי לחסום את השקופיות, החל טיפה אחת של הריג'נט החוסם על שטח של 14 מילימטר על 14 מילימטר. להדגירה את המגלשות במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. מניחים את השקופיות על מגבת נייר כדי לאפשר לריג'נט החוסם לברוח מהמגלשה ולנגב בעדינות את הקצוות.
השתמש בדילול הנוגדנים כדי לדלל את הנוגדנים העיקריים. החל 40 microliters של פתרון הנוגדנים העיקרי מדולל לכל שטח 14 על 14 מילימטר על השקופיות. מניחים את המגלשות בתא לח, ודגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.
בבוקר, לשטוף את המגלשות פעמיים במשך חמש דקות, כל אחד עם 50 מיליליטר של חיץ לשטוף 1x A בטמפרטורת החדר בצנצנת קופלין. מניחים את צנצנת הקופלין על שייקר מסלולית 60 סל"ד. מניחים את השקופיות על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר הכביסה לברוח מהמגלשה ולנגב בעדינות את הקצוות.
הכינו פתרון של 40 מיקרוליטר המכיל בדיקות פלוס ומינוס. הוסף את הפתרון לכל חלל של 14 על 14 מילימטר. להדגירה את המגלשות בתא לח במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
לשטוף את השקופיות פעמיים במשך חמש דקות כל אחד עם 50 מיליליטר של חיץ לשטוף 1x A בטמפרטורת החדר בצנצנת קופלין. מניחים את צנצנת הקופלין על שייקר מסלולית 60 סל"ד. מדללים את מאגר הקשירה 1 עד 5 במים אולטרה-חמים.
השתמש במאגר זה כדי לדלל את הרצועה 1 עד 40 כדי להכין מלאי עבודה של פתרון קשירה. מניחים את השקופית על מגבת נייר כדי לאפשר למאגר לשטוף לרוץ מהצדדים, ולנגב בעדינות את הקצוות. הוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון הרצועה לכל חלל של 14 על 14 מילימטר.
להדגירה את המגלשות בתא לח במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר כביסה וייבוש של המגלשות כפי שתואר קודם לכן, הוסיפו 40 מיקרוליטרים של תות פתרון הגברה טרי, המוגן מפני אור, לכל חלל של 14 על 14 מילימטר. הדגירה את המגלשות בתא לח וחשוך במשך שעה ו -40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 10 דקות כל אחד עם 50 מיליליטר של חיץ לשטוף 1x B, ולשטוף את השקופיות פעם אחת במשך דקה אחת עם 50 מיליליטר של חיץ לשטוף 01x B.לאחר ייבוש ההיקף מצופה אפוקסי של השקופית, להוסיף 10 microliters של מדיום הרכבה לכל מדגם, בעדינות להניח כיסויים על גבי, המאפשר מדיום הרכבה להתפשט. צבעו סביב קצה הכיסוי עם לק כדי לאטום את המכסה ולהחליק. הימנע מהזזת המכסה.
תן לק ציפורניים להקשיח לפחות 20 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. חיסון שותף של הנבטים עם נוגדני FLAG ו- GFP חשף את דפוס הביטוי שלהם בנבט. בעוד GFP בא לידי ביטוי לאורך כל הנבט, ביטוי OMA-1:GFP הוגבל pachytene מאוחר oocytes.
חיסון דגל מראה כי 3xFLAG:DLC-1 בא לידי ביטוי לאורך הנבט בשני הזנים. אזור העניין לכמית PLA בחיידק הקיף את הפשיטן המאוחר דרך הביציות בכל הנבטים. זהו האזור של ביטוי OMA-1.
3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP נבטים נראה שיש כמות גדולה יותר של FOCI PLA בתוך אזור זה לעומת 3xFLAG:DLC-1, נבטים GFP. ודא שיש מספיק מים כדי להעלות את הלחות בתא. כמו כן, ודא כי שקופיות הם ברמה בתוך התא כדי למנוע נגר של רייגנטים.
לאחר בדיקה של רצועות קירבה, ניתן לדמיין את הקנאדות המובלטות במיקרוסקופ קונפוקלי ולכומת אותן באמצעות פיג'י, זרימת עבודה של ImageJ. כימות זה יכול לעזור לקבוע אם האינטראקציה היא מובהקת סטטיסטית. PLA אפשרה לנו להעריך באינטראקציות situ בין הרגולטורים הקריטיים של התפתחות נמטודה נבט.
