הפרוטוקול שלנו מתאר את השימוש בצבעי BODIPY קונבנציונליים למיקרוסקופיה ברזולוציית-על באמצעות מצבם הדליל וההזזה האדומה. זה מאפשר לנו ללמוד organelles ו biomolecules בתאים חיים עם רזולוציה של 30 ננומטר. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות שלה ואת הרבגוניות של תכשירים שונים זמינים BODIPY המספקים מקור לאורך זמן של אותות מולקולה אחת.
היישום המוכח שלנו יכול להיות חשוב כדי לקבל תובנות במחלות כגון מחלת כבד שומני או סוכרת מסוג 2 על ידי פתרון טיפות השומנים וחומצת שומן מתחת למגבלת ההתעקנות. אנו מקבלים תובנה בביולוגיה של חומצות שומן ושומנים בתאי שמרים ויונקים. עם זאת, טכניקה זו ישימה לכל סוגי התאים השקופים האחרים עם פלואורסצנטיות ברקע נמוך.
בעת שימוש בטכנאי בפעם הראשונה, הקפד לייעל את ריכוזי di ואת כוחות הלייזר, כדי לבחון אותות מולקולה אחת בהירה. הדגמה חזותית של טכנאי זה חשוב לראות כיצד ריכוז ואופטימיזציה של כוח לייזר תוצאות אותות מולקולה אחת בהירה. שמור על תאי U2OS של היונקים ב- DMBM שאינו פלואורסצנטי עם סרום שור עוברי 10% ארבעה גלוטמין מילימולרי, נתרן פירובט מילימולרי אחד ואנטיביוטיקה סטרפטומיצין פניצילין באחוז אחד בבקבוק T-25.
לפצל את התאים ב 70 עד 80% confluency לאחד עד חמש, ו pipette באר אחת של צלחת שמונה באר. לשנות את התאים בצלחת שמונה באר במשך 12 עד 24 שעות. עשר דקות לפני הדמיה זה, להוסיף BODIPY-C12 Lysotracker ירוק או מצומד BODIPY אחרים, להוסיף ריכוז סופי של 100 nanomolar.
התקן את ערכות המסננים המתאימות בנתיב הפליטה בהתבסס על צבע הפליטה של BODIPY בשימוש. תדליק את המיקרוסקופ. שלב מיקרוסקופ, לייזרים 488 ננומטר ו 561 ננומטר, כמו גם את המצלמה.
מוסיפים טיפת שמן עולה על מטרת המיקרוסקופ. פתח את תוכנת HAL4000 השולטת באור ה-LED להדמיית שדה בהיר, כוחות לייזר, תריסי לייזר והגדרות מצלמה להדמיה. הגדר את הרווח EMCCD ל 30 וטמפרטורת המצלמה למינוס 68 מעלות צלזיוס.
הכן את המצלמה ואת התוכנה המתאימה להקליט סרטים ב 20 הרץ. הפעל את תנור שלב המיקרוסקופ והגדר אותו לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ולרמה של פחמן דו חמצני של חמישה אחוזים. התאימו את צבע תיקון המטרה בהתאם.
הר את הדגימה על שלב המיקרוסקופ והתמקד עד שמערכת המיקוד תלחץ. הזז את השלב באמצעות בקר השלב עד שיופיעו תאים בריאים בשדה התצוגה. לטעון רצפי תריס לייזר עבור העירור של monumus, כמו גם דימרים, אשר כוח לייזר של לייזר 561 ננומטר בין 821 קילוואט לסנטימטרים רבועים עבור מיקרוסקופ לוקליזציה מולקולה אחת, כך, נקבוביות פלואורסצנטיות מולקולה אחת מזוהים בערוץ הפליטה אדום-עבר.
כוונן את כוח הלייזר בין נקודה 035 לנקודה 07 וואט לסנטימטר מרובע עבור לייזר 488 ננומטר, כך פלואורסצנטיות קונבנציונלית מופיעה בערוץ הפליטה הירוקה. בחר תיקיית יעד לסרטים והקליט מסגרות רכישה של 5000 עד 20000 כדי לאסוף מספיק לוקליזציה לבנייה מחדש של תמונות ברזולוציית על. עבור לשדות תצוגה שונים וחזור כדי לאסוף נתונים עבור תאים נוספים.
טען את הסרט לתוכנה לניתוח מיקרוסקופיה של לוקליזציה של מולקולה אחת. הקרנה חזותית של הסרט והתאמת הגדרות הניגודיות, כך שנראה מהבהב פלואורסצנטי של מולקולה אחת. כדי להגדיר פרמטרי זיהוי מולקולה אחת להתאמת 2D Gaussian, PSFs.
סנן באופן חזותי דרך כמה מסגרות לדוגמה כדי לבדוק את פרמטרי הזיהוי, ולזהות באופן אמין את התפרצויות הפלואורסצננט הבודדות המובהק של מולקולה אחת. לחץ על ניתוח כדי לבצע מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה אחת לדמיין ניתוח עם פרמטרי זיהוי אופטימיזציה. ואז, לעבד כל מולקולה אחת כמו 2D Gaussian שרוחבו משוקלל על ידי השורש הריבועי ההופכי של מספר הפוטונים שזוהה.
להעריך את איכות הנתונים. השתמש בטווחי מסגרות מוגבלים כדי לצפות בהפצות מולקולה בודדת במקרים ובזמן ספציפיים יותר. זה מסביר את תנועת organelle במהלך רכישת נתונים.
במחקר זה, הצגנו הליך הכנה, רכישת נתונים וניתוח מדגם אופטימיזציה עם מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה אחת באמצעות BODIPY conjugates. כדי להדגים דוגמה של זרימת העבודה עבור רכישה וניתוח של נתונים מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה אחת, BODIPY בשמרים הועסק כדי לפתור טיפות השומנים מתחת למגבלת העקיפה האופטית. דוגמאות של מצבי הדמיה צבעוניים שונים של BODIPY בהטיה עם בדיקות אחרות כגון GFP ו mEos2 מוצגים כאן.
BODIPY-C12 נוצר באשכולות טיפה ניידים שאינם שומנים בפריפריה התא על צום, בניגוד שילובם טיפות השומנים בתנאים האכילו. כדי להרחיב עוד יותר את יכולת המיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה אחת של BODIPY מדביק לתאי יונקים, BODIPY-C12 ו Lysotracker ירוק בתאי U2OS חיים דימוי. אופטימיזציה של ריכוז BODIPY, כמו גם מרגש כוחות הלייזר הם צעדים קריטיים על מנת לדמיין אותות מולקולה אחת בהירה, ולשחזר תמונות ברזולוציה סופר.
שיטה זו יכולה לשמש עם כל BODIPY אחרים conjugate כדי לקבל תובנה ברזולוציה גבוהה, בהתפלגות הזמן המיוחדת של ביו מולקולות ספציפיות בתוך תאים חיים. הטכנאי שלנו סלל את הדרך, כדי לחקור עוד יותר את טיפת השומנים וביולוגיה של חומצות שומן בסולם העדשות הננוסקופיות. עם זאת, יישום זה חורג בהרבה מהפילופקטים הספציפיים בשל הזמינות של תכשירים פונקציונליים שונים של BODIPY.
אנא הקפד לעקוב אחר נהלי ההפעלה הסטנדרטיים לטיפול בדגימות הביולוגיות ובצבעים, וגם להיות המגדרים המחייבים שלנו ולעקוב אחר נהלי הבטיחות בלייזר.
