רוב קווי הת תירס inbred לא ניתן לשנות גנטית באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה קונבנציונליים. כאן, אנו מתארים שיטת טרנספורמציה QuickCorn כי הוא מהיר ופחות תלוי גנוטיפ. שיטת QuickCorn משתמשת בגורמי שעתוק תירס בייבי בום ו-WUSCHEL.
כאשר הם משולבים במערכת וקטור הטרנספורמציה, גנים אלה פועלים בסינרגיה כדי לעורר צמיחה עוברית. שלא כמו פרוטוקולי טרנספורמציית תירס קונבנציונליים, השיטה QuickCorn אינה כרוכה בשלב אינדוקציה של callus במהלך הטרנספורמציה. אזור T-DNA של הווקטור הבינארי המשמש בעבודה שלנו מכיל שלושה מרכיבים מרכזיים, גנים מורפוגניים, גנים של סמן, ואת מערכת recombination cre / loxP.
מערכת רקומפינציה cre / loxP הנגרמת על ידי חום נכללה ב- T-DNA כדי להסיר את הגנים המורפוגניים מהגנום תירס כדי לאפשר התחדשות callus נורמלי בפיתוח הצמח. בערך יומיים-שלושה לאחר שהתגלו משי, ואם אבקה תהיה זמינה למחרת, חותכים את המשי וההצקה עם מספריים מעוקרים של 70%, בערך 2 וחצי ס"מ מתחת לקצה עלי ההצצה, שם מגיחים המשי ומכסים את המשי בשקית יורה. ברגע שאתרים מגיחים מתוך צצוץ, מכסים את הצאסל בשקית צצוץ, ומ מניחים אקליפ נייר ללא החלקה בבסיס התיק סביב הגבעול.
בבוקר שלאחר הנחת שקית הצצה, לכופף בעדינות את הצמח, והקש על התיק כדי לעודד אבקה להשתחרר. לאחר מכן להסיר את שקית צבר, ולקפל את החלק העליון של התיק מעל כדי למנוע אבקה לברוח. כדי להאביק צמח המטופל, לחשוף את המשי, במהירות לשפוך אבקה משקית ציצית על המשי.
מכסים מיד את האוזן האבקה עם שקית צסל, ולאבטח את הבסיס של התיק סביב הגבעול עם סיכות. כדי לבדוק את גודל העובר לא בוגר, תשעה עד 12 ימים לאחר ההאבקה, בעדינות למשוך את הזרימה כדי לחשוף את הגרעינים בערך 1/3 כדי 1/4 של היקף האוזן ועל 1/3 של המרחק במורד האוזן. השתמש באזמל כדי לחתוך את המכסה של גרעין יחיד שנראה דומה לרוב הגרעינים האחרים בגודל ובצבע, ולהשתמש מרית עם סרגל כדי לחלץ את העובר.
לאחר מכן השתמש בסרגל או בקליפר כדי למדוד את אורך העובר. בתוך יום עד ארבעה ימים של הקציר, להסיר את הפקקים והמשי מן האוזניים שנקטפו, ולהכניס ידית מתאימה לתוך החלק העליון או הבסיס של כל אוזן. להטביע את האוזניים במיכל גדול של ת פתרון אקונומיקה חיטוי במכסה המנוע לזרימה למינאר סטרילית עם הידית פונה כלפי מעלה.
לאחר 20 דקות, לשטוף את האוזניים שלוש פעמים עם נפח נדיב של מים מזוקקים סטריליים טריים במשך חמש דקות לכל לשטוף לפני המאפשר לאוזניים להתייבש במשך כמה דקות. לאחר מכן, מלא צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של שני מיליליטר לאוזן במדיום נוזלי 700A, ולהשתמש באזמל סטרילי כדי להסיר את החלק העליון של אחד עד שני מילימטרים של כל כתר קרנל כדי לחשוף את האנדוספרם של האוזן. אתר את העובר הלקוי בתוך הקרנל בצד הפונה לקצה האוזן, ליד ההחזקה לקורח.
עבור המטפל העליון ומפעילים ימניים, הנח את האוזן על צלחת פטרי סטרילית גדולה, והכנס מרית מיקרו לתוך האנדוספרם ב pericarp הרחוק ביותר מן העובר. בעדינות לסובב כלפי מעלה כדי לנטרל את האנדוספרם ולחשוף את העובר, ולהשתמש מרית בזהירות למקם את העובר לתוך צינור אחד של 700A מדיום נוזלי. עבור מפעילי מטפל בסיס מחזיק את האוזן ביד שמאל, להכניס מרית מיקרו לתוך האנדוספרם ב pericarp הרחוק ביותר מן העובר, בעדינות לסובב כלפי מעלה כדי לנטרל את האנדוספרם.
כדי לתרבת את העוברים בתרבות השעיית אגרובקטריום, לאסוף חיידקים מצלחת עבודה מוכנה טרי לתוך 10 מיליליטר של מדיום נוזלי 700A, ומערבולת להשעות את תרבות החיידקים לחלוטין. למדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 550 ננומטר, ולשטוף את העוברים עם מיליליטר אחד של מדיום 700A טרי. לטבול את העוברים במיליליטר אחד של השעיית אגרובקטריום, ומערבולת על הגדרה נמוכה במשך 30 שניות.
ליישב את העוברים על הספסל עם הצינורות בכיוון אופקי במשך חמש דקות לפני העברת כל התוכן של כל צינור על צלחות בודדות של 562V שיתוף טיפוח בינוני. מערבבים בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את העוברים באופן שווה, ושואף את ההשעיה העודפת של אגרובקטריום. בזהירות לכוון את העוברים עם הצד בצורת כיפה פונה כלפי מעלה, דואג כדי למנוע נזק לעוברים.
ואז למקם צלחות לתוך קופסאות פלסטיק עבור דגירה לילה ב 21 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת בבוקר, להעביר בזהירות עוברים נגועים על מנוחה בינונית 605T, מקום כ 30 עוברים לכל צלחת, צד scutellum למעלה, עבור דגירה של ארבעה עד 10 ימים ב 26 מעלות צלזיוס בחושך. בסביבות שבעה ימים, התפתחות עובר סומטית ניתן לראות על פני השטח של scutellum זיגוטי.
בתום תקופת המנוחה, מניחים את קופסת העוברים באינקובטור של 45 מעלות צלזיוס עם 70% לחות יחסית למשך שעתיים, ולאחר מכן דגירה של שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס בחושך. בסוף הדגירה, מניחים 10 עד 15 עוברים לא בוגרים בהלם חום על צלחות בודדות של היווצרות לירות בינוני בתוספת 05 מיליגרם לליטר של קוטל עשבים imazapyr כסוכן סלקטיבי. הסר בזהירות את כל הקולופליחים לפי הצורך, והחזר את העוברים לאנקובטור הכהה של 26 מעלות צלזיוס למשך שבועיים.
בסוף הדגירה, מעבירים כשמונה חתיכות של רקמה לכל צלחת על בסיס צלחות בינוניות עבור דגירה של שבוע עד שבועיים עם 16 שעות של אור ושמונה שעות של חושך ב 27 מעלות צלזיוס. ככל שהצמחיות מתפתחות, מניחים צמח אחד חזק יותר המכיל הן יורה והן שורשים נמרצים על צלחות בודדות של מדיום השתרשות תחת אור במשך שבעה עד 14 ימים נוספים. אפשר יורה כי הם לא מפותחים באופן מלא להיות דגירה על אותו מדיום במשך עוד שבוע עד שבועיים עד שהם מוכנים לעבור לאדמה.
ככל שהצמח הופך נמרץ יותר, לשטוף את השורשים עם מי ברז כדי להסיר אגר. לאחר מכן להשתיל את הצמחים בודדים לתוך סירים שלושה אינץ 'המכיל מצע ללא אדמה רטוב מראש במגש עם חורי ניקוז, ולמקם את המגש בתא צמיחה עם או בלי כיפת לחות פלסטיק. תשעה עד 14 ימים לאחר העברת חשיש, להשתיל כל צמח עם אדמה לתוך סיר 1.5 ליטר.
מוסיפים לסיר דשן בשחרור מבוקר, ושומרים על הצמחים בחממה. כאשר יורה האוזן מתחילים לצאת מן הצמח, להשתמש בשקית לירות חצי קדם כדי לכסות את היורה, כך המשי המתעוררים ניתן לראות מבלי להסיר את התיק. לאחר מכן להאביק את הצמחים בשלב המתאים של פיתוח כפי שהוכח.
אוזני הת תירס נקצרות בדרך כלל תשעה עד 12 ימים לאחר האבקה. עוברים לא בוגרים באורכים הנעים בין 1.5 לשני מילימטרים הם המתפוצצים הטובים ביותר לשינוי עבור פרוטוקול זה. שמונה ימים לאחר ההדבקה, עוברים סומטיים המבטאים ZsGreen יכולים להיות חזותיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
טיפול בחום שמונה ימים לאחר ההדבקה גורם לביטוי cre recombinase, וכתוצאה מכך כריתה של הגן המורפוגניים, cre, ו ZsGreen ביטוי קלטות מוקף בין שני אתרי loxP. לאחר שלושה עד ארבעה שבועות של תרבות על לירות היווצרות בינוני המכיל קוטל עשבים, רקמות מתרבות עם עוברים התבגרות או לירות ניצנים עמידים קוטל עשבים ניתן לראות. חלק מהרקמות עמידות בפני קוטל עשבים עשויות להיות שליליות עבור ZsGreen, מה שמרמז כי כריתה מתווכה cre סביר התרחשה ברקמות אלה.
לאחר העברת הרקמות השתרשות דגירה בינונית וקלה, בריא, נמרץ, גדל יורה עם שורשים מפותחים ניתן לקצור. שים לב כי רקמות מסוימות עשויות להיראות יש יורה מרובים אולי בשל צמחים שיבוט בעל דפוסי אינטגרציה מהומר זהה. שיטת QuickCorn יכולה לשפר מאוד את יעילות טרנספורמציית הת תירס ולהרחיב את רשימת הגנוטיפים הניתנים לשינוי.
הפרוטוקול יכול להיות משוחזר בהצלחה על ידי חוקרים עם אימון טרנספורמציה תירס מינימלי. באמצעות שיטת QuickCorn, צמחים מושרשים צריכים להיות מוכנים לעבור לאדמה רק חמישה עד שבעה שבועות לאחר יום הזיהום. שימו לב להרכב הבינוני, לתזמון תת-התת-תרבות ולתנאי הטמפרטורה והתאורה.
איכות החומרים ההתחלתיים חיונית גם לטרנספורמציה מוצלחת. הכימיקלים, פתרון האקונומיקה קוטל עשבים המשמשים בפרוטוקול זה הם biohazardous. אנא הקפד ללבוש את ציוד ההגנה האישי המתאים במהלך השימוש בהם.
