פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מודד כמותית phagocytosis של שכותרתו Aspergillus fumigateurs Conidia על ידי לויקוציטים אנושיים, יחד עם ההחזקה של Conidia לתאים, וחוסר אינטראקציה על ידי ציטומטריית זרימה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מקלה על ניתוח מהיר של מספר רב של תאים. בנוסף, תיוג של סמני התא מאפשר להפריד הערכה של נויטרופילים ומונוציטים בתוך אותה מדגם.
בכל טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לנתח פטריות רלוונטיות קליניות אחרות כמו Mucorales. במקום זאת תאי דם אדומים עשויים לשמש phagocytes. כדי להתחיל בהליך זה, הרטיב מגבת נייר עם חומר חיטוי, והכנס אותה לארון בטיחות ביולוגי.
מניחים צלחת של אספרגילוס פומיגטוס גדל על גבי מגבת נייר כדי למנוע הפצת יתר של Conidia נדיף. מוסיפים 10 מיליליטר של PBS המכילים 0.01% חומר ניקוי על גבי הפטרייה, ולהשתמש מרית Drigalski להפיץ את הנוזל על הצלחת, ולשפשף את Conidia בצבע כהה. העבר את ההשעיה Conidia ל 50 מיליליטר דרך מסננת 30 מיקרומטר, אשר יסיר כל מיסליה שיורית.
מוסיפים עוד 10 מיליליטר של PBS עם חומר ניקוי לצלחת, להפיץ אותו עם מרית, ולהעביר אותו לאותו צינור דרך מסננת. לאחר מכן, להכין פתרון סטרילי של 0.1 נתרן פחמתי טוחן, מומס PBS. ולהכין פתרון 0.1 מילימולרי של אבקת FITC, בתתבה זו נתרן קרבונט.
להשעות מחדש 100 מיליון או פחות Conidia, בחמישה מיליליטר של פתרון FITC זה, בצינור 15 מיליליטר. דגירה במסובב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. כדי להתנפח לקונדיה, יש להשתמש מחדש ב-FITC שכותרתו Conidia בחמישה מיליליטר של מדיום RPMI, בתוספת 10%FCS.
ותדוגר בסובב ב-37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי. בארון בטיחות ביולוגי, מניחים חמישה מיליליטר של מעיל באפי לתוך צינור 50 מיליליטר. מלא את הצינור עם חיץ EL, והתהפך שלוש פעמים.
דגירה אופקית במשך חמש עד שמונה דקות, עד המראה החלבי של התערובת הופך ברור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 300 פעמים G, ו בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. השלך את העל-טבעי והתקן מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של חיץ EL על-ידי צינורות.
הוסף עוד 24 מיליליטר של חיץ EL, ולהפוך את הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במיליליטר אחד של מדיית RPMI, בתוספת 10%FCS.
כדי להתחיל, להעביר שני מיליון לויקוציטים וארבעה מיליון CONIDIA FITC שכותרתו 1.5 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% FCS, לצלחת תרבות 12 היטב. כלול פקד של תאים ללא קונידיה בלבד ושליטה בתאים עם Conidia ללא תריס. אין לארוב את הצלחת באינקובטור פחמן דו חמצני לח, ב 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
כאשר הדגירה הושלמה, להשתמש מגרד תאים כדי לקצור את התאים, ולהעביר אותם צינור 15 מיליליטר. ראשית, לשים 100 microliters של כל מדגם שולט לתוך באר אחת של צלחת V-התחתון 96-well. הוסף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכביסה.
לפיצוי צבע, מקם מיליון תאים ללא Conidia עבור כל צבע, בארות אחרות של הצלחת. כלול באר של תאים שישארו ללא מעצורים. הוסף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכל באר לכביסה.
לאחר מכן, מכסים את הצלחת בנייר דבק, ואת הצנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את נייר הכסף ולהשליך את העל טבעי על ידי היפוך מהיר וכוחי של הצלחת רק פעם אחת מעל הכיור, או מגבת נייר חד פעמית. תערבב את התאים ב-100 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים, ותערבב היטב על ידי צינורות.
לפיצוי צבע, יש להשתמש מחדש בתאים המתאימים ב-100 מיקרוליטרים של PBS המכילים שני מילימולרים של EDTA, ולהוסיף סוג נוגדן יחיד לכל באר, באותה כמות המשמשת בתמהיל הנוגדנים. מכסים בנייר דבק, ו דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 20 דקות. לאחר מכן, להסיר את נייר הכסף ולהוסיף 150 microliters של PBS המכיל שני מילימולר של EDTA לכל באר לכביסה.
מכסים את הצלחת בנייר דבק שוב. צנטריפוגה ב 300 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן להסיר את נייר הכסף, ולהשליך את העל טבעי על ידי היפוך מהיר וכוחני של הצלחת מעל כיור או מגבת נייר חד פעמית.
תן שימוש חוזר בתאים ב-200 מיקרוליטרים של PBS המכילים 2 מילימולרים EDTA, והעבר את מתלי התא מכל באר, לצינור תחתון עגול נפרד. התחל את ציטומטר הזרימה, ותן לו להתחמם. בתוכנת הרכישה, צור ניסוי חדש והגדר ותייג את הדגימות החדשות.
הגדר את הפרמטרים ואת הגלאים עבור הפלואורופורים המתאימים, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בתוכנה זו, הצג את התוויות הנקודות המתאימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. באמצעות התאים רק לדגום, לרכוש תאים מסוימים ולהגדיר את השער סביב לויוציטים.
מבוסס על שער לויוציט, שער לתאים חיוביים CD45, להיפרד Conidia בעלילה SSC CD45. בעלילה נקודה, CD14, CD66b, נויטרופילים שער מונוציטים בנפרד. לאחר מכן, עבור מהתאים רק מדגם, לקונידיה ללא תריס.
בעליית נקודה, אנטי-FITC, APC FITC, הצג נויטרופילים ברבעים מוגדרים לאותות אנטי-FITC ו-FITC. פתח את תצוגת הסטטיסטיקה והתאם את הרבעים, ואפשר עד 1% מהתאים ברבעים Q1, Q2 ו- Q4. חזור על תהליך זה עבור שער המונוציטים. בשער לויוצ'יט, רשום את כל הדגימות עם לפחות 20,000 אירועים.
Phagocytosis של FITC שכותרתו Conidia על ידי נויטרופילים אנושיים ניתן לקרוא מן ההשקפות הסטטיסטיקה. במחקר זה, שיטה ציטומטרית זרימה מהירה משמשת למדידת האינטראקציה של אספרגילוס fumigateurs Conidia עם מספר רב של לויקוציטים אנושיים ראשוניים. באמצעות הנוגדנים המתאימים ואת האסטרטגיה gating המוצגים כאן, gating כללי של לויוציטים אנושיים על ידי מאפייני FSC ו- SSC, ואחריו הפרדה של לויוציטים בקונידיה חינם, על ידי סמן פאן לויוציטים, CD45.
Conidia יכול להגיע כמעט גודל התא בזמן ציטומטריה זרימה, במיוחד בעת שימוש Conidia נפוח, או זמני דגירה ארוכים, ולכן יכול לקנות לנו ניתוח. מאז מונוציטים ראשוניים אנושיים נויטרופילים לקחת Conidia באופן שונה, פרוטוקול זה מאפשר ניתוח נפרד של אוכלוסיית תאים אלה מבוסס, על כתמים עם סמני שושלת התא הוקמה היטב, CD14 עבור מונוציטים, ו CD66b עבור נויטרופילים. אחוז phagocytes העיקרי האנושי הפנמת Conidia יכול להיות משתנה מאוד בקרב תורמי הדם, אבל גם תלוי בגורמים ניסיוניים, כגון זמן הדגירה מצב נפיחות של Conidia.
הפנמת נבגים ניתן לזהות לאחר 0.5 שעות של דגירה שותף, ועליות עם הזמן. Conidia טרום נפוח נלקחים קל יותר מאשר נבגים נחים, אפילו בזמני דגירה קצרים. אם Conidia קבועים עם פורמלדהיד, phagocytosis מצטמצם בהשוואה קונידיה הילידים.
בעקבות הליך זה, על-טבעיים של תאים חיסוניים דוגרים במשותף ו Conidia ניתן לאסוף ולנתח על ידי אלייזה כדי לבדוק אם האינטראקציה מעוררת שחרור ציטוקינים על ידי התאים החיסוניים. אנא זכור, דם אנושי יכול להעביר מחלות זיהומיות. עבודה זו דורשת חיסון ברחבי הפטיטיס B, שימוש בארון בטיחות ביו, כמו גם ללבוש כפפות במעיל מעבדה.
