שיטה זו יכולה לסייע בקביעת דרישות האבקה במינים שונים ולבסס יחסי אי התאמה בין זנים. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שהיא מאפשרת להעריך מספר אי התאמה בתנאי מעבדה. הימנעות מבעיות רבות שעלולות להתרחש בניסויים המבוצעים בתנאי שדה.
זה מאפשר זיהוי יחד עם מסירות של מספר cultivar לקבוצות אי תאימות המתאימות. קביעת הקשר הבין-תאימותי בין זנים. גישה זו יכולה גם להיות שימושית כדי לקבוע את חוסר תאימות עצמית ואת יחסי אי תאימות בגידולים אחרים עץ פרי כמו דובדבן או שזיף.
התחל על ידי דגימת הפרחים בשדה. לאסוף את הפרחים בשלב בלון, אשר מתאים שלב 58 בסולם BBCH עבור משמש כדי למנוע האבקה קודמת. במעבדה, להסיר את anthers של הפרחים מניחים אותם על פיסת נייר להתייבש בטמפרטורת החדר.
לאחר 24 שעות, לנטר את גרגרי האבקה עם רשת בסדר 26 מילימטר. לסרס קבוצה של 30 פרחים באותו שלב התפתחותי בלון עבור כל האבקה עצמית צולבת ולה מניחים את האקדחים על קצף הפרחים במים 24 שעות לאחר סירוס ולהאביק את האקדחים באמצעות מברשת צבע עם אבקה מפרחים של אותו cultivar. להאביק קבוצה נוספת של אקדחים של כל cultivar עם אבקה מפרחים של מאביק תואם כפקד.
לאחר 72 שעות, להסיר את האקדחים מקצף הפרחים הרטובים ולתקן את האקדחים בתמצית תיקון של 3:1 אתנול לחומצה אצטית לפחות 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן השלך את התיקון והוסף 75%אתנול, וודא שהדגימות שקועות לחלוטין בפתרון. דגימות ניתן לאחסן באתנול ב 4 מעלות צלזיוס עד השימוש.
מפזרים את גרגרי האבקה של אותם זנים המשמשים להאבקות הבקרה במדיום נביטת אבקה מוצק ומתבוננים בהם מתחת למיקרוסקופ לאחר 24 שעות. הכינו את האקדחים למיקרוסקופיה על ידי שטיפתם 3 פעמים במים מזוקקים במשך שעה אחת לכל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, להשאיר אותם 5% נתרן סולפיט ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
ואז autoclave אותם בקילוגרם אחד סנטימטר בריבוע במשך 10 דקות נתרן סולפיט כדי לרכך את הרקמה. מניחים את האקדחים autoclaved מעל מגלשת זכוכית ולהשתמש אזמל כדי להסיר את trichomes סביב השחלה. ואז למחוץ את האקדח עם כיסוי.
החל טיפה של כחול אנילין על ההכנות כתם תצהירים קשוחים במהלך צמיחת צינור אבקה ולצפות צינורות אבקה לאורך הסגנון עם מיקרוסקופ על פי הוראות כתב היד. השתמש בערכה מסחרית כדי לחלץ דנ"א גנומי מעלים צעירים שנאספו באביב. לאחר מכן הגדר את PCR על-ידי שילוב רייגנטים בהתאם לכיווני כתב היד.
מערבולת התגובה לערבב ולהפיץ אותו בין בארות בצלחת PCR. הוסף מיקרוליטר אחד של דילול הדנ"א לכל באר והפעל את PCR באמצעות תוכנית התרמו-רכיבה על אופניים המתוארת בכתב היד. לאחר השלמת התגובה, לנתח את התוצאות באמצעות אלקטרופורזה נימי או אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
עבור אלקטרופורזה נימי להוסיף 1 microliter של המוצר PCR לתוך באר של צלחת הקורא יחד עם 1 טיפה של שמן מינרלי כדי למנוע אידוי מים. לאחר מכן הכינו את לוח ההפרדה על-ידי הוספת מאגר הפרדה. השתמש בתוכנה המסחרית עבור מנתח הגנים כדי ליצור צלחת מדגם חדשה ולשמור את שמות המדגם עבור כל בארות על הצלחת.
לאחר מכן בחר את שיטת הניתוח והכנס את שתי הלוחות לתוך מנתח הגנים. ממלאים את מערך נימי במים מזוקקים. לטעון את ג'ל פוליאקרילמיד ליניארי ולחץ לרוץ.
אם מנתחים את תוצאות ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, הכינו ג'ל 1%agarose על ידי המסת אגרוז במאגר פועל אלקטרופורזה בהתאם לכיווני כתב היד. לאחר מכן מוסיפים 4 מיקרוליטרים של כתם חומצת גרעין לג'ל ומערבבים בעדינות. הגדר מגש ג'ל עם מסרק והאטה לשפוך את הג'ל באמצע דואג להימנע בועות.
השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר עד שהתמצקות מלאה, כ-30-45 דקות. ואז לשים בתא אלקטרופורזה. הסר את המסרק ולכסות אותו עם מאגר TAE 1x.
לטעון את הג'ל עם סולם ה-DNA ואחריו מוצרי PCR מעורבב עם טעינת צבע. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 90 וולט במשך 60-90 דקות עד קו הצבע הכחול הוא כ 75% של נתיב ג'ל. לאחר השלמת הריצה, דמיינו את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור.
צמיחת צינור האבקה עצמית והאבקה צולבת נצפתה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לקבוע תאימות עצמית (ב) עבור כל cultivar. זנים נחשבו עצמית עולה בקנה אחד כאשר צמיחת צינור אבקה נעצר ותואם את עצמו כאשר לפחות צינור אבקה אחד הגיע לבסיס של הסגנון. 5 שילובי זוג פריימרים שימשו לזיהוי S-alleles באמצעות PCR בשילוב עם אלקטרופורזה נימי או ג'ל.
ראשית, ה-S-alleles זוהו על ידי הגברה של ה-S-RNase intron הראשון באמצעות זוג פריימר SRc. ואז האסטרון השני של RNase הוגבר עם שלושה סטים פריימר להבחין S6, S9, S1, ו S7 אללים. ואזורי משתנה V2 ו- HVB של הגן SFB הוגברו עם פריימר AprFBC8 להגדיר לזהות את אללים Sc ו- S8.
לאחר שזוהו ה- S-alleles, ניתן ליצור קבוצות שונות של אי-תאימות עם הגנוטיפים שאינם תואמים זה לזה. חשוב לזכור להשתמש בשליטה באלקטרופורזה נימית, שכן הם משתמשים במערכת ניתוח שברים אוטומטית שיכולה לדווח על הבדלים נוספים בגודל הקטע וגורמים לזיהוי אלל לא מדויק. השילוב של תצפיות מיקרוסקופיות וניתוח גנטי הביא לגישה שימושית מאוד כדי לקבוע אי התאמה עצמית של משמש ולבסס את יחסי אי התאמה בין זנים.
אי התאמה עצמית היא כיום הקישור למקומיים משמש. נראה כי קביעת הגורמים מעורבת. מאמץ עתידי צריך להיות ממוקד בהטמימות הגנטית של הכת הזו במ משמש.
השילוב של גישה תיעודית זו הוא תוצאה של מידע רב ערך עבור הבחירה המתאימה של זנים במטעים מסחריים גנוטיפים דפוס בתוכניות רבייה משמש. גישה דומה ניתן להשתמש בגידולים רב שנתיים עציים אחרים.
