פרוטוקול זה מתאר את הקמתו של מודל עכבר חדשני לחקר פטריית העור, Malassezia, ואת האינטראקציה שלה עם עור היונקים ב vivo. בניגוד לגישות במבחנה, מודל זיהום זה מאפשר חקר של מנגנוני חיסון המולדים וההסתגלותיים נגד מלזיה במורכבות המלאה ובאופן ספציפי לרקמות. Malassezia קשורה להפרעות עור שונות, כגון אטופיק דרמטיטיס.
הבנת התגובה החיסונית פטרייה עשוי לספק אסטרטגיות חדשניות לטיפול במחלות עור דלקתיות תכופות וכרוניות כאלה. זיהום עור ניסיוני עם Malassezia מספק מודל המיוחל לחקר האופן שבו פטריות עור קומנסלי לווסת את המערכת החיסונית ובכך להשפיע על הקורס והחומרה של הפרעות עור שונות. כדי להכין Inoculum Malassezia להוסיף 10 מיליליטר של מדיום mDixon נוזלי ושלוש עד חמש מושבות Malassezia בודדים מצלחת mDixon אגר לבקבוק סטרילי 100 מיליליטר ארלנזייר.
לאחר מכן מניחים את הבקבוק ב 30 מעלות צלזיוס ו 180 סיבובים לדקה במשך 48 עד 96 שעות. כאשר התרבות היא בצבע קרם ועכור, להעביר שני מיליליטר של התרבות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי שני מיליליטר ומזיק את השמרים על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS עבור צנטריפוגה שנייה ואחריו הפוגה במיליליטר אחד של PBS טרי עם צינורות נמרצים.
לדלל את ההשעיה Malassezia 20 עד 50 פעמים עם PBS כדי להבטיח כי הקריאה היא בין 0.1 ואחד ולמדוד את OD 600 על ספקטרומטר. Aliquot נפח של ההשעיה Malassezia ב PBS שמתאים OD 600 של ארבעה לתוך צינור אחד סטרילי שני מיליליטר לכל בעל חיים להידבק ולעים את השמרים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן תן שימוש חוזר כדורי ב 200 microliters של שמן זית מקומי.
כדי ליזום זיהום Malassezia, לאשר חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר C57 Black6 נקבה הרדמה שישה עד שמונה שבועות ולהחיל משחה על העיניים של החיה. השתמש caliper כדי למדוד את העובי של שני אזורים שונים של שתי האוזניים כדי לאפשר חישוב של העובי הממוצע לכל אוזן. לאחר מכן להחיל חתיכה קטנה של קלטת על העור של אוזן אחת לפני במהירות להסיר את הקלטת מעור האוזן חמש פעמים באמצעות פיסת קלטת חדשה בכל פעם.
לאחר החשפנות, השתמשו בצנרת סטרילית כדי למרוח 100 מיקרוליטרים של מתלי שמן הזית Malassezia לצד הגבי של כל אוזן והזריקו 200 מיקרוליטרים של פתרון סטרילי, 2% גלוקוז לפני המלחמה, תת עורית לקפל הנוצ'ל כדי לתמוך בחילוף החומרים וההידרציה. לאחר מכן לאפשר לעכבר להתאושש על כרית חימום במשך 30 דקות עם ניטור לפני החזרת החיה לכלוב שלה. בנקודות הזמן הניסיוניות המתאימות, השתמש בקליפר כדי למדוד שני אזורים שונים של כל אוזן עכבר כדי לאפשר חישוב של העובי הממוצע לאוזן.
כדי למדוד את הנטל הפטרייתי בעור הנגוע, הוסיפו 500 מיקרוליטרים של צינור סטרילי 0.05%NP40 במים מזוקקים וכדור פלדה בקוטר 5 מיליליטר אוטומטי לצינור מיקרוצנטריפוגה אחד של שני מיליליטר לאוזן ושקלו כל צינור על איזון. לאחר מכן, לקצור את האוזניים מכל בעל חיים בבסיס ולמקום את הרקמות לתוך צינורות בודדים של NP40. לשקול כל צינור על האיזון כדי לקבוע את המשקל של כל דגימת אוזן לפני homogenizing את רקמות האוזן במשך שש דקות ב 25 הרץ.
לאחר מכן מחלקים 100 מיקרוליטרים של כל דגימה על צלחות אגר mDixon ולהפיץ את המתלים הומוגנית על פני אגר לפני הדגירה הפוכה שלהם ב 30 מעלות צלזיוס. כאן תמונות מייצגות לצמיחה של Malassezia sympodialis במדיום mDixon נוזלי על mDixon אגר כפי שהוכח מוצגים. עלייה בעובי האוזן ניתן לראות לאחר Malassezia furfur יישום לעור כי כבר מחסום שיבש בהשוואה לעור ללא הפרעה של עכברים מסוג פראי C57 Black6.
ואכן, כימות העלייה בעובי האוזן לאורך זמן מגלה כי השינוי בעובי משמעותי בהשוואה לעור המטופל ברכב. יתר על כן, הנטל הפטרייתי בעור האוזן ביום השני לאחר ההדבקה עם Malassezia pachydermatis הוא 100 עד 1000 פעמים מעל מגבלת הגילוי. Malassezia נוטה ליצור אגרגטים והוא לא ניתן להשעות בקלות.
לכן, להבטיח הומוגניזציה של השעיית פטריית השמן על ידי מערבולת נרחבת. נתונים נוספים עשויים לכלול, היסטולוגיה כדי לקבוע את פתולוגיה העור ואת הבידוד של תאים חיסוניים מן העור ניקוז בלוטות הלימפה כדי לחקור את התגובה החיסונית נגד פטריות. מודל זה פותח את ההזדמנויות ללמוד את התגובה החיסונית נגד Malassezia ולחקור את תפקידה של הפטרייה כמקום בהקשר של הפרעות עור שונות.
מינים Malassezia מסווגים אורגניזמים BSL-2 במדינות מסוימות. הקפד לפעול בהתאם לתקנות הרשויות המקומיות שלך ולהשתמש באמצעי הבטיחות המתאימים.
