יעילות transfection נמוכה היא מכשול מרכזי כדי לקבוע כיצד חלבון מחדש נויריט תיעוב בנוירונים ראשוניים. הפרוטוקול שלנו להתגבר על בעיה זו על ידי שיתוף transfection של EGFP כדי לזהות תאים שהועתקו בהצלחה. שיעור השיתוף-transfection הגבוה של EGFP וחלבוני הריבית מבטיחים את דיוק ההתוודאות.
וכתוצאה מכך, כתמי שפעת חיסונית נדרשים כעת. כמו גידול neurite מתרחשת במהלך התחדשות עצבית, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על זיהוי של מטרות חדשניות לשיקום הרשת העצבית פגום בטראומה מוחית או מחלות ניווניות. לפני תחילת ההליך, מניחים כיסוי עגול סטרילי של 18 מילימטר לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמות 12 היטב ומעיל כל מכסה עם חמישה מיקרוגרם למילימטר של פתרון פולי-D-ליזין באינקובטור 37 מעלות צלזיוס לח במשך שעה אחת לפחות.
בסוף הדגירה, שאפו את תסנובת הפולי-די-ליסין ושטוף את הכיסויים במים סטריליים. ביום העוברי 18, מניחים את הרחם שנקטף מעכברוש ספראג דאוולי בהריון מתוזמן לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולהשתמש מספריים לנתח קטן כדי לפתוח את הרחם ואת שיכר מי האמון. השתמש במספריים כדי להסיר את שליה ולהשתמש ממטרים להעביר עובר שלם אחד לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל גלוקוז PBS צונן.
השתמש במספריים כדי לחתוך לאורך התפר sagittal של הגולגולת ולהשתמש מרית שטוחה קטנה להעביר את המוח העוברי לתוך צלחת פטרי חדש 10 ס"מ המכיל קרח טרי קר PBS גלוקוז. באמצעות שני פינצטה מספר חמש ומיקרוסקופ ניתוח, להפריד את שתי ההמיספרות המוחיות מן המוח הקטן גזע המוח ולהסיר את קרום המוח. לאחר מכן לבודד את קליפת המוח מן ההמיספרות המוחיות ולמקום את קליפת המוח בצינור 15 מיליליטר המכיל גלוקוז PBS קר קרח טרי.
לתרבות נוירונים קליפת המוח העיקרית, ב ארון biosafety בכיתה II, לאפשר קליפת המוח להתיישב על ידי כוח הכבידה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני החלפת גלוקוז PBS עם 0.05% טריפסין EDTA. מערבבים עם הקשה עדינה לה דגירה הרקמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם הקשה עדינה נוספת כל שתי דקות. בסוף הדגירה, לעצור את העיכול עם ארבעה מיליליטר של מדיום תחזוקה ולהשתמש פיפטה מיליליטר אחד כדי לנטרל את הרקמה עם טריטורציה עדינה.
להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה עבור צנטריפוגה שנייה. תן מחדש את גלולה נוצר לאחר הצנטריפוגה השנייה במיליליטר אחד של מדיום תחזוקה טרי לספירה צלחת הנוירונים מבודדים ב 6.5 פעמים 10 לתאים קיימא הרביעית ריכוז בריבוע סנטימטר אחד של אמצעי תחזוקה לאורך 12 צלחת היטב. לאחר יומיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, לדלל EGFP וחלבון היעד פלסמיד DNAs ו reagent transfection בשני צינורות נפרדים 1.5 מיליליטר ולאחר מכן לערבב אותם יחד.
לשנות את התאים עם מבנה EGFP על ידי הוספת תערובת transfection ל בארות. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים עם 37 מעלות צלזיוס PBS ולתקן אותם עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים עם PBS טרי לכל לשטוף ולהוסיף נפח מינימלי של מדיום הרכבה פלואורסצנטי על שקופית אחת זכוכית מיקרוסקופ לכל מדגם.
לאחר מכן העבר בזהירות את הכיסויים הצפויים למדיית ההרכבה כאשר הדגימות פונות לשקופיות הזכוכית. כדי לדמיין את צמיחת הנויטריט, בחר את המטרה 40X במיקרוסקופ epifluorescent ולחץ להתחיל ללכוד תמונות של לפחות 40 נוירונים חיוביים EGFP שלמים לכל transfection. כאשר כל neurites כבר בתמונה, לפתוח את התמונות שנתפסו ImageJ עם תוסף NeuronJ ולמדוד את האורך של neurite הארוך ביותר של כל נוירון מגוף התא לקצה חרוט הצמיחה.
לאחר מכן לנתח את הנתונים שהושגו עם התוכנה כדי לקבוע את ההשפעה של חלבונים ממוקדים על צמיחת neurite. ציטוכלאסין D מדכא הרחבת neurite באופן תלוי מינון בעוד צמיחת neurite משופרת נוירונים שטופלו עם גורם גדילה עצבי. בנוסף, חלבון מתאם הצמיחה העצבי FE65 מגרה באופן משמעותי גידול של נויריט פי שניים בהשוואה לנוירונים לא פתורים.
למרות יעילות transfection נמוכה, ניתוח immunofluorescence מגלה כי מעל 80% של תרבות תאים יומיים ניתן לבצע בהצלחה שיתוף פעולה עם EGFP ו FE65. ביטוי EGFP מזוהה בשש שעות לאחר ההמרה בעוד FE65 מזוהה לראשונה בשעה 12 ושני האותות מזוהים עד שבעה ימים לאחר ההמרה. ההטמנה של נוירונים קליפת המוח עכברוש ראשי עם כמויות שונות של FE65 פלסמיד DNA מגלה עלייה תלוית מינון בהרחבת neurite עם 0 עד 0.5 מיקרוגרם של FE65 פלסמיד.
עם זאת, אין הבדל משמעותי בצמיחה נצפתה נוירונים מנוקטים עם 0.5 או מיקרוגרם אחד של פלסמיד. בעת ניסיון הפרוטוקול, חשוב לבודד את האזור המתאים מהמוח העוברי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על המחקר של צמיחה עצבית בנוירונים אנושיים שמקורם iPSC אשר יש כלים יקרי ערך לרפואה רגנרטיבית.
