הבדיקה הכפולה של סרגל הדנ"א יכולה לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוזום ולבדיקה של תזוזות חומצות גרעין אחרות. הבדיקה הכפולה שלנו של סרגל הדנ"א היא כרגע השיטה היחידה שיכולה לחקור באופן אובייקטיבי הן את צדי הכניסה והן את צדי היציאה של mRNA במתחמים הריבוזום ברזולוציה של נוקלאוטידים יחידים. שיטות דומות מיושמות גם כדי למדוד את כוח מחייב DNA ואת הבחירה של תרופות כימותרפיות.
הדגמה חזותית של השיטה היא הזדמנות טובה עבורנו להראות באופן אינטואיטיבי את היתרונות של הטכניקה שלנו ולעזור לחוקרים אחרים להמשיך לפתח אותה ליישומים נוספים. כדי להתחיל, לעשות מדגם פלסטיק היטב עם רצועת styrene על ידי קידוח קובייה במרכז עם מידות של ארבעה מילימטרים על ידי שלושה מילימטרים על ידי שני מילימטרים. לאחר מכן, באמצעות אפוקסי, הדבק חתיכת זכוכית מצופה ביוטין, באורך של כחמישה מילימטרים, אל פני השטח התחתונים.
הוסף 20 microliters של 0.25 מיליגרם לכל פתרון מים סטרפטבידין מיליליטר לתוך המדגם היטב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 40 דקות. לאחר מכן שטפו היטב את הדגימה פעמיים עם מאגר TAM10. כדי לשתק את קומפלקסים ריבוזום ללא אנטיביוטיקה, תחילה להסיר את המאגר מן המדגם היטב, ולהוסיף 20 microliters של 0.1 מיקרומולרי MF-Pre או MF-Post ריבוזום מורכבים לתוך המדגם היטב.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת עם חיץ TAM10. קומפלקס הריבוזום נקשר כעת עם הסטרפטבידין על פני השטח דרך הביוטין של חמשת הפריים ב-mRNA. לניסוי באמצעות אנטיביוטיקה, דגירה תשעה microliters של קומפלקס MF-Pre עם microliter אחד של ארבעה neomycin מילימולרית, 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
ואז לשלב בצינור 0.6 microliters של 60 מיקרומולרים EFG, 0.8 מיקרוליטרים של 100 מיקרומולרים GTP, 0.8 מיקרוליטר של 100 מילימולרים PEP, 0.3 מיקרוליטר של 1.3 מיליגרם למיליליטר פירובט קינאז, 6.43 מיקרוליטר TAM10 חוצץ, ומיקרוליטר אחד של חמישה חומצה fusidic מילימולרית. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן לשלב את שתי תערובות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות נוספות.
לבצע את הניסויים אנטיביוטיקה אחרים באופן דומה, עם ריכוזים של 0.2 מילימולרית viomycin, 0.4 מילימולרית hygromycin B, ו 0.25 חומצה fusidic מילימולרית. לצורך מחקר הסטת מסגרת, חזור על הדגירה עבור מתחמי MFNF-Pre המערבים את המוטיב החלקלק, U6A. כלול אנטיביוטיקה של חומצה fusidic בתוספת neomycin.
יש צורך בזמן מספיק כדי להבטיח את השלמת תהליך ההכלאה. מומלץ גם להשתמש במאגר TAM10 עם שומה אחת בפועל נתרן כלורי כדי לשמור על מערכת הומוסטדית. לאחר הדגירה, הסר מאגר מהדגימה היטב.
מוסיפים 20 מיקרוליטרים של גדיל דנ"א אחד של בדיקה ביו-מולארית, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה. בבוקר, לשטוף את ה-DNA שנוצר / mRNA דופלקס פעם אחת עם חיץ TAM10. הסר את המאגר מה באר הדוגמה.
לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של 0.5 מיליגרם למיליליטר ציפוי דם מגנטי לתוך הדגימה היטב, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, הכנס בזהירות את הדגימה היטב לתוך מחזיק, והצב אותה בצנטריפוגה כדי להסיר את החלקיקים המגנטיים החופשיים מפני השטח במהירות של פי 84 למשך חמש דקות. תדליק את הלייזר.
לאחר מכן לחץ על לחצן ההפעלה. כוונן את הרגישות ל-500 מילי-וולט, והמתן כשעתיים כדי להתחמם ולייצב את המגנטומטר האטומי. כדי להגדיר את המגנטומטר האטומי, הפעל את תוכנת בקרת המכשירים והגדר את מצב המעבר של המנוע לרעש ואת מיקום ברירת המחדל לאפס.
לחץ על נעל בלוח הקדמי. כוונן את הרגישות בחזרה ל-200 מילי-וולט. כוונן את הזרם והמתח של הלייזר, ולמצוא את שיא תהודה נכונה ואת רמת אות לרעש עבור רזולוציית האות הטובה ביותר.
לחץ על נקה בלוח הקדמי. ודא כי יחס משרעת לרוחב הוא מעל 0.5 וערך הפאזה קטן מחמש מעלות עם רוחב קטן מ- 170 הרץ. חבר את הפלט של מגבר נעילה אחר SR530 למשוב של הלייזר כדי לנעול את התדר שלו.
חבר מחולל פונקציות ATF20B כדי להזין גל מרובע של 500 מילי-וולטים לשיא, 100 מילי-הרץ כאות הייחוס להמרת זרם לאות מגנטי. לאחר מכן נתק את מחולל הפונקציות. הגדר את מצב המעבר של המנוע למיקום דו-כיוון וברירת מחדל ל- 260 מילימטרים.
בדוק את מצבו של בקר הטמפרטורה, כדי להבטיח את הטמפרטורה היא כ 37 מעלות צלזיוס, של החיישן האטומי. בדוק את היציבות של המערכת כולה פעמיים על ידי הפעלה ישירה של התוכנית מבלי לטעון דגימות כדי למדוד את האותות של מחזיק הדגימה הריק. כדי למגנט את הדגימות, יש להשתמש בעדינות פינצטה כדי להוציא את הדגימה מהמחזיק, ולהצבה על במת המגנטיזציה למשך שתי דקות.
לאחר מכן להחזיר את הדגימה למחזיק הדגימה, ואת הצנטריפוגה ב 335.4 פעמים g במשך 20 דקות. הסר את החלקיקים המגנטיים שאינם קשורים באופן ספציפי. לאחר מכן לטעון את המדגם על המנוע עם פינצטה.
לחץ על נעל בלוח הקדמי כדי להפעיל את התוכנית. בינתיים להשתמש פינצטה לטעון מדגם נוסף לתוך המחזיק, ולמקום אותו לתוך הצנטריפוגה. הפוך את צד הזכוכית מצופה פונה למרכז הצנטריפוגה, ולהתחיל את הצנטריפוגה ב 335.4 פעמים g במשך ארבע דקות.
כאשר המנוע חוזר לאפס, לאחר כחמש דקות, לחץ על שמור בלוח הקדמי. בזהירות להשתמש פינצטה להעביר דגימה אחת מהמנוע למחזיק צנטריפוגה. החל כוח חזק יותר על ידי הגדלת המהירות הצנטריפוגלית על ידי 100 סל"ד או גודל צעד דומה.
החלף את הדגימה לצנטריפוגה. לעבד לסירוגין כדי להגדיל בהדרגה את הכוח בכל פעם. ספקטרום כוח שלם מתקבל לאחר 10 עד 12 נקודות נתונים.
כאשר כל הניסויים המתוכננים הסתיימו, לכבות את הציוד, להמשיך בסדר ההפוך כפי שהוא היה מופעל. מוציאים את הדגימות מהמחזיק, ומטבולים אותן באתנול לניקוי ושימוש עתידי. לנקות את מחזיק הדגימה עם אצטון במקרה של זיהום חרוז מגנטי.
בפרוטוקול זה, מתחם הריבוזום היה משותק על פני השטח, דרך הקצה החמישי של ה-mRNA, והפך הן את הצד של חמשת הפריים והן את הצד השלישי לנגישים בקלות עבור שליטי הדנ"א. כאשר הקישור של הצד של חמשת הפריים היה ארוך יותר מ-50 תימין, אות מגנטי חזק זוהה, מה שמצביע על היווצרות מוצלחת של דופלקסים של DNA/mRNA. על ידי שינוי מספר הנוקלאוטידים בדנ"א, המתאם של כוח הדיסוציאציה לאורך הדופלקס הושג עבור שלושת הצדדים המובילים וחמשת הפריים, בהתאמה.
התוצאות של טרנסלוקציה נורמלית מ- MF-Pre ל- MF-Post, בהיעדר אנטיביוטיקה, מראות כי הריבוזום נע על ידי שלושה נוקלאוטידים לכיוון הקצה השלישי בשני הצדדים. MF-Pre נשא fMet-tRNA נוודים ופנילאלנין-tRNA באתרי P ו- A, בהתאמה, בעוד MF-Post נשא fMet-tRNA ו פנילאלנין-tRNA באתרי E ו- P, בהתאמה, עם אתר A ריק. עם זאת, כאשר גם חומצה fusidic ואנטיביוטיקה adiomycin היו נוכחים, ריבוזום נע רק על ידי נוקלאוטידים אחד בצד חמישה ראש אבל שני נוקלאוטידים בצד שלושה ראש.
לאחר שטיפת האנטיביוטיקה, התרחשה טרנסלוקציה נורמלית, כפי שמוצג על ידי שלוש תנועות נוקלאוטידים משני הצדדים של חמשת הפריים ושלושת הפריים. כאשר ממגנטים את הדגימה, המשטח הציפוי צריך להתקרב ולהשאיר את המגנט אנכית. והסרת החלקיקים המגנטיים שאינם קשורים באופן ספציפי חשובה מאוד לדיוק ואיכות הנתונים.
הטכניקה שלנו מספקת רזולוציה גבוהה ודרך ישימה בדרך כלל לחקור עקירה מולקולרית של חומצת גרעין אשר נתקל נרחב בביולוגיה מולקולרית.
