בידוד תאי השריר האנושי המווסתים את התחדשות שרירי השלד מאפשר לנו לחקור תהליכים המעמידים ביסוד תהליך ההתחדשות תוך שמירה על השונות התורם. טכניקה זו מאפשרת תשואות גדולות של תאי אביהם של השרירים האנושיים להתקבל כמויות קטנות של רקמות וניתוח פנוטיפי שלהם באמצעות מספר קטן של תאים. שיטה זו תוכננה במיוחד כדי לבודד תאים של שרירים אנושיים כדי לעקוב אחר יכולות ההתפשטות והבידול שלהם ולקשר נתונים אלה לתהליך התחדשות שרירי השלד.
ההיבט הקשה ביותר של טכניקה פשוטה למדי זו היא להבטיח שכל צעד מבוצע באופן משוחזר כדי לייעל את התשואה והטוהר של התאים. ישנם שלבים מרובים שיש להשלים לבידוד מוצלח של התאים. כמה מהצעדים קלים יותר להבנה אם הם נצפו באופן חזותי.
כדי לבודד תאים של שרירים אנושיים מרקמה ביופסית, מניחים את רקמת השריר בצלחת פטרי סטרילית בתנאים סטריליים, ולהשתמש באזמל סטרילי כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קוביות של מילימטר אחד. כאשר כל הרקמה כבר טחון, להעביר את החלקים לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של PBS, ולאפשר את הרקמות להתיישב על ידי כוח הכבידה לפני בזהירות שאף את העל טבעי מבלי להפריע לרקמה. לאחר שטיפת שברים בפעם השנייה כפי שהודגם רק, להחליף את PBS עם 10 מיליליטר של דל גלוקוז Dulbecco של דל גלוקוז שונה הנשר מדיום.
הסר את העל-טבעי לאחר שהרקמות יושבו, ולחץ מחדש על החלקים בשלושה מיליליטר של מדיום עיכול. מניחים את הרקמות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, עם טריטורציה של שברי השריר כל 10 דקות עם פיפטה סרולוגית מיליליטר אחד. בסוף הדגירה, להוסיף 83 microliters של מדיום עיכול נוסף 24 microliters של פתרון Dispase לדגימות, ו triturate את הרקמות כל חמש עד 10 דקות עם קצה פיפטה רחב נשא עד תרחיף אחיד מושגת.
תרחיף אחיד חשוב להתאוששות מקסימלית של תאי העורף של השריר האנושי. המשך לעיכול אם תרחיף לא עובר דרך קצה פיפס סטנדרטי 1, 000 מיקרוליטר. כדי לבודד את התאים החיוביים Pax7, כתם ושער התאים על פי הפרוטוקול.
מיין את CD56, CD29 כפול חיובי תאי שריר אנושי על ציטומטר זרימה עם זרבובית 100 מיקרומטר בלחץ של 20 פאונד לאינץ 'מרובע לתוך צינורות איסוף המכיל כרית 300 מיקרוליטר של חיץ מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות. ואז לזרוע את תאי הצאצאים שריר אנושי ממוין לתוך צלחות מצופה קולגן 24 באר המכיל מדיום צמיחה מחומם מראש ב 3.5 פעמים 10 לתאים הרביעיים ריכוז בריבוע סנטימטר. לביצוע סריקות קונפלונס, העמיסו את הלוח על ציטומטר הדמיה ובחרו 'צור סריקה חדשה' ו'קטגוריית לוח', 'פרופיל לוח' ו-Plate ID.Under Application, בחרו 'קונפלונס' ו'קונפלונס 1' ובחרו באר להצגה.
אתר מישור מיקוד שבו התאים נראים לבנים בהשוואה לרקע ובחר רשום ידנית. השתמש בעכבר כדי לסמן את כל בארות שיש לסרוק, ובחר התחל סריקה. כל אזור באר ייסרקו באופן אוטומטי.
בחר את הגדרות הניתוח האופטימליות עבור סוג הלוח והתא ובחר התחל ניתוח. השתמש בציטומטר ההדמיה כדי למדוד קונפלונס בתחילה. לאחר מכן לספור את התאים על ציטומטר ההדמיה, להחליף את המדיום בכל באר עם 200 microliters של פתרון הכתמים.
לאחר 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את פתרון הכתמים עם 100 microliters של F12 של האם טרי. החזירו את הלוח לציטומטר ההדמיה, ותחת יישום, בחרו 'כדאיות תא' ו'סה"כ חי מת'. הערוץ החי יהיה תמונת שדה בהיר, הערוץ המת יראה את הכתמת הפרופידיום יודיד, וערוץ סה"כ יהיה הכתמת Hoechst 33342.
תחת הגדרת מיקוד, לחץ על רשום אוטומטית. תחת הערוץ סכום כולל, הגדר את הערוץ לכחול. השתמשו ב'חפש מוקד' כדי להביא את הגרעינים לפוקוס ולחצו על 'הגדר היסט' לבחירת המוקד.
תחת הערוץ Dead, הגדר את הערוץ לאדום ולהשתמש ב'חפש מוקד' כדי להתמקד בתאים המתים. לחצו על 'הגדר היסט' לבחירת המוקד ובחרו 'התחל סריקה' כדי להתחיל בסריקה. לאחר מכן בחרו בפרמטרי הניתוח המתאימים לסוג הלוח והתא ובחרו 'התחל ניתוח' כדי להתחיל בניתוח.
לאחר השלמת הניתוח, ודא באופן חזותי שהניתוח ספר כראוי את התאים. אם הסריקה והניתוח משביעי רצון, החזירו את הלוחית לאנקובטור, סרקו או שנו מחדש את פרמטרי הניתוח. תאי גוף שריר אנושי יכול להיות מזוהה על ידי אירועי gating הראשון מבוסס על אזור פיזור בצד קדימה כדי לחסל תאים מתים או פסולת, ואחריו בחירת רק את התאים שליליים עבור 7-AAD ולכן הם קיימא.
התאים החיוביים הן עבור סמני משטח תא CD56 והן עבור סמני משטח תא CD29 מייצגים את אוכלוסיית תאי הצאצא של השריר האנושי. תאי אביהם של השרירים האנושיים יכולים להיות מזוהים גם על ידי ביטוי Pax7 שלהם. ואכן, Pax7 מועשר באוכלוסייה הכוללת לאחר FACS ומתוחזק באמצעות מעברים מרובים.
כאן, מוצגת סריקת קונפלונס מייצגת. קווי המתאר הירוקים נוצרו על ידי ציטומטר ההדמיה ומראים כיצד ציטומטר ההדמיה קבע את הקונפלונס בהתבסס על הגדרות הניתוח שנבחרו. ספירת הטרוגניות וגרעין נפוצה בין תורמים.
גילוי ואפיון מדויק של הטרוגניות זו הוא יישום מפתח של ציטומטר ההדמיה. מדידות הקונפלונס וספירת הגרעינים מתורמים ייחודיים, לעומת זאת, מתואמים מאוד. תאי אבי שרירים אנושיים מובחנים כדי ליצור myotubes ניתן להבחין על ידי ביטוי שרשרת מיוסין העוברי שלהם כבד.
חשוב להיות עקבי בעת בחירת הפרמטרים gating על ציטומטר זרימה על מנת לבודד את אותה אוכלוסייה של תאים מכל תורם. לאחר מבודד, תאי צאצא שריר אנושי יכול לשמש למטרות מרובות, כולל זיהוי הדרישות המטבוליות הייחודיות של התפשטות והתבוללות של תאים מולדים שריר אנושי. הבידוד של תאי הצאצא של השריר האנושי איפשר אפליה של ההבדלים בביטוי סמן פני השטח של התא על תאי הצאצא של שרירי האדם והעכבר.
