SgRNA המפולג שלנו שנקרא הקרנת הספרייה, היא גישה גנטית רבת עוצמה לזהות ולהעריך את הפונקציה הביולוגית של האלמנטים שאינם קידוד ברחבי הגנום. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחון את ההשפעה של שיבוש האתרים המחייבים הקשורים, גבולות כרומטיים או אלמנטים רגולטוריים אחרים על ביטוי גנים ממוקדים. הגישה שלנו יכולה לשמש כדי לזהות את התפקיד של CTCF, ארוך ללא קידוד RNAs ומשפרים, בוויסות גנים HOX בהתפתחות העוברית המוקדמת, כמו גם לוקמיה מסוימים עם חתימת גנים חריגה HOX.
התחל הליך זה עם העיצוב של sgRNA מיקוד אתרי איגוד CTCF. שיבוט ספריית sgRNA בהכנת תא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לארוז את lentivirus, cotransfect HEK293 T תאים עם 20 מיקרוגרם של וקטורים ספרייה מטוהרים, 15 מיקרוגרם של פלסמיד ארוז, ו 10 מיקרוגרם של פלסמיד המעטפה, במשך 48 שעות לפני קצירת הנגיפים.
לאחר 48 שעות, לאסוף את הנגיף supernatant ולסנן אותו דרך 0.45 מיקרון חלבון נמוך מחייב קרום PVDF. לאחר מכן, לרכז את על טבעי lentiviral על ידי 50 לקפל, באמצעות concentrator. יש לייחס את הנגיפים המרוכזים ולאחסן אותם במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס.
עבודה בארות נפרדות של צלחת 12 גם לערבב MOLM13 תאים עם מינונים שונים של lentivirus מרוכז עבור שש קבוצות סה"כ. מיד צנטריפוגה תערובות אלה ב 1000 פעמים גרם במשך שעתיים ב 33 מעלות צלזיוס. מעבירים את 12 צלחות באר בחזרה לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות.
השאפת בעדינות את העל-טבעי מבלי להפריע ללאט התאים, והשהה מחדש את התאים שהתומרו עם RPMI 1640 Medium טרי בתוספת. לאחר מכן להעביר את התאים מושעה מחדש כדי T25 flasks ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ללא puromycin. לאחר 48 שעות לפצל תאים אלה לשני flasks, קבוצת ניסוי שטופלו microliter אחד למיליליטר puromycin במשך חמישה ימים, קבוצת ביקורת ללא טיפול puromycin במשך חמישה ימים.
למדוד את ערך MOI אופטימיזציה עבור ההעתקה על ידי חלוקת מספר תאים חיים שטופלו puromycin על ידי מספר התאים ללא טיפול puromycin. כדי לשנות את התאים עם הספרייה מאגר, להדביק 1.5 מיליון תאי MOLM13 בצלחת 6 באר עם 0.3 MOI של sgRNA מאגר lentivirus במדיום. השתמש בתאים ללא זיהום lentivirus כפקד.
מיד צנטריפוגה צלחת ששת גם ב 1000 פעמים g במשך שעתיים ב 33 מעלות צלזיוס כדי ספין-להדביק את התאים. לאחר מכן, להעביר את הצלחות בחזרה לאנקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות. יש לשאוף בעדינות על-טבעי מבלי להפריע ללאט התאים, ולהשעות מחדש את התאים המתומרים במדיום טרי.
לאחר מכן, להעביר את התאים כדי T25 flasks ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות ללא puromycin. לאחר 48 שעות, לטפל בתאים עם מיקרוגרם אחד למיליליטר puromycin במשך חמישה ימים. יש להחליף למדיום טרי לאחר יומיים ולשמור על צפיפות תאים אופטימלית.
זרע את השיבוט היחיד ב 96 צלחות גם עם שיטות דילול מגבילות. דגירה אלה שיבוט יחיד ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תרבות אותם במשך 3-4 שבועות.
לספור את התאים MOLM13 משולב SgRNA עם 0.4%טריפאן כחול פתרון מכתים ולאחר מכן להעביר 10, 000 תאים חיים לגם לצלחת PCR 96 היטב. צנטריפוגה הצלחת ב 1000 פעמים g במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר ביסודיות להשליך את supernatant עם פיפטה. הימנע מלהפריע ללטף התאים.
לאחר שטיפת התאים כמתואר בטקסט להוסיף 50 microliters של תות התא לערבב מאסטר לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי להשעות מחדש את לוח התאים. הדגירה את התערובת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מעבירים את התערובת ל-37 מעלות במשך חמש דקות, ואז 75 מעלות במשך חמש דקות נוספות. עכשיו להוסיף microliter אחד של lysate תא ל הבאר PCR המכיל את תערובת התגובה QPCR RT. תערובת זו כוללת את הגנים סמן קדימה והפך פריימר, תעתיק הפוך ותערובת תגובה צעד אחד.
הפעל את תגובת שעתוק הפוכה במשך 10 דקות ב 50 מעלות צלזיוס ואחריו הפעלת פולמריזציה, ו DNA-denaturation במשך דקה אחת ב 95 מעלות צלזיוס. בצע את RT PCR עם 40 מחזורים של תגובת PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ודא את שיבוטי הביטוי מופחת HOXA9 באמצעות רצף סנגר ולבצע PCR עם דנ"א הגנום MOLM13 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לחלץ ולטהר את מוצרי PCR עם ערכת טיהור PCR. Ligate את מוצרי PCR מטוהרים לתוך וקטור T עם חיץ קשירה T4, DNA וקטור T, DNA PCR ו- T4 ligase. מניחים את תערובת הרצועות באינקובטור ב 16 מעלות צלזיוס לילה.
מעבירים את תערובת הקשירה לתאים מוסמכים אלפא DH5 צלחת על צלחת אגר אנטיביוטי אמפצילין LB. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס. בחרו את השיבוטים הבודדים מצלחת ה-LB ואמתו אותם על-ידי רצף גנוטיפינג וסנגר.
הגדר את קבוצת תערובת הטרודופלקס עם 200 ננוגרם של הייחוס, ו 200 ננוגרם של אמפיליקונים PCR בדיקה בצינור PCR 0.2 מיליליטר. כלול את קבוצת תערובת homoduplex עם רק 400 ננוגרם של אמפיליקונים PCR הפניה כפקד. בנפרד דגירה תערובת הטרודופלקס ו homoduplex ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות בבקבוק ליטר אחד מלא 800 מיליליטר של מים.
לאחר מכן, לקרר את תערובות בהדרגה לטמפרטורת החדר כדי anneal וצורת הטרודופלקס או homoduplex. עכשיו, בנפרד לעכל 400 ננוגרם של תערובת הטרודופלקס annealed ו homoduplex עם microliter אחד של נוקלאז גילוי מוטציה indel, ושני microliters של חיץ תגובת נוקלאז ב 42 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לנתח את הדגימות מתעכל עם אלקטרופורזה ג'ל אגרוז.
יש לחתוך את הדנ"א של תערובת ההטרודופלקס לרסיסים קטנים ואין לחתוך את הדנ"א ההומודופלקס. sgRNA מיקוד MOLM13 שיבוטים חיוביים אושרו עם שיטת RT qPCR, בהתבסס על רמות הביטוי של גנים HOXA9 עם ההשוואה עם תאי הבקרה. מתוך 528 השיבוטים ששרדו, 10 שיבוטים הציגו ירידה של יותר מ-50% ברמות HOXA9.
sgRNAs משולב HOXA9 מופחת, HOXA9 ללא שינוי HOXA9 שיבוטים מוגברת, אושרו עוד יותר על ידי הגברה PCR של sgRNA וזיהוי על ידי רצף סנגר. שישה מתוך עשרה שיבוטים המראים ירידה ברמות HOXA9 הכילו sgRNAs מיקוד באתר CBS79, כפי שנקבע על ידי רצף סנגר. מוטציות Indel של שיבוטים חיוביים sgRNA משולב נקבעו על ידי pcR מבוסס genotyping ועיכול גרעין.
המחיקה ההטרוזיגית של אתר CTCF הממוקם בין הגנים HOXA7 ו HOXA9 זוהתה על ידי genotyping מבוסס PCR. שיבוטים ירד HOXA9 חמש, שש, 28 ו 121 הציג מחיקה במיקום הגבול CBS79. תוצאות דומות נצפו עבור מוטציות indel באתר CBS79 שנותחו על ידי הבדיקה עיכול גרעין.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעשות כמויות שוות של הטרודופלקסים ו homoduplexes על מנת לזהות מוטציות indel הנגרמת על ידי sgRNA באמצעות הבדיקה עיכול גרעין. הגישה שלנו מאפשרת ניצול של הסמן שנבחר, לבצע רצף הדור הבא על גן היעד כדי לגלות את ההשפעות של הגן על leukemogenesis. בסך הכל הגישה שלנו מונעת RPC של לתיקון תפקודי וצמצום של אלמנטים גנטיים לא סדירים ציין במהלך תהליך ביולוגי נורמלי leukemogenesis בשגיאת פרויקט הגנום שלאחר המוות.
