פרוטוקול זה מקל על השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים עבור יישומי סינון תוכן גבוה. זה מתאים במיוחד עבור לתעתע סינפסות, אשר בנוירונים אנושיים דורשים תקופות תרבות ארוכות. אנו מדגימים את ההחזרה של נוירונים ממנות בפורמט גדול לתוך בארות מרובות תואמות HCS באופן המשמר את הכדאיות שלהם.
בניגוד אינטואיטיבי, אנו מראים כי הרחבת דגירה פרוטאז לפני resuspending ו replating מניב הישרדות עצבית משופרת. תאי עצב אנושיים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים רלוונטיים יותר ויותר בתחומים של מחקר בסיסי, פיתוח תרופות ורפואה ניוונית. ניתן להשתמש בשיטת טיטורציה עדינה זו כדי לעכל מחדש כל שכבה מונו-שכבתית גדולה של תאים שיש להם רשת עבה של תהליכים.
בנוסף iPSCs אנושי, זה יכול לשמש כדי להתגמש תרבות של נוירונים ראשוניים או כדי resuspend אותם עבור מיון עובדות או רצף תא יחיד. חשוב לעקוב אחר שלבי הפרוטוקולים בזהירות ולעתים קרובות לפקח על הניתוק מתווך פרוטאז של הנוירונים מהצלחת. זמן הדגירה האופטימלי עשוי להשתנות, בהתאם לתרבות.
הדגמה חזותית מאפשרת אפילו לחוקרים לא מנוסים לשחזר הליך זה. התחל על ידי שטיפה עדין את הצלחת של נוירונים מובחנים עם PBS. לפזר את PBS במורד הקיר של הצלחת ולא ישירות על התאים, כדי למנוע שיבוש אותם.
שאף את ה- PBS מקצה המנה תוך כדי הטיה, תוך כדי שהוא דואג לא לגעת בתאים. יש למרוח לפחות מיליליטר אחד של אנזים פרוטאוליטי לכל צלחת של 10 ס"מ. ולהחזיר את התאים לאנקובטור במשך 40 עד 45 דקות.
במהלך הדגירה, לבדוק נוירונים על מיקרוסקופ ניגודיות בשלבים ולהמשיך את הטיפול פרוטאז עד הרשת העצבית מתנתק לחלוטין מהצלחת ומתחיל להתפרק. כאשר הנוירונים התנתקו, להפסיק את העיכול על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיה DEMEM טרי עבור כל מיליליטר אחד של פרוטאז. השתמש פיפטה סרולוגית בעדינות titrate התאים נגד הצלחת חמש עד שמונה פעמים, הקפדה לא להחיל יותר מדי לחץ.
מסננים את התאים דרך רשת של 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, טיפה אחר טיפה. ולשטוף את מסננת עם חמישה מיליליטר נוספים של מדיה DMEM טרי. השתמש בצנטריפוגה ספסל העליון לסובב את התאים למטה ב 1000 פעמים G במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, להחזיר את הצינור חרוט לארון biosafety ושואף את רוב התקשורת, עוזב 250 microliters כדי לשמור על התאים לחים. בעדינות resuspend התאים בשני מיליליטר של מדיה DMEM טרי ואז להעביר אותם דרך הסוף של פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר. לבסוף, להפוך את הצינור פעמיים עד שלוש פעמים.
השתמש בהמוציטומטר וכחול טריפן כדי לספור את התאים קיימא. ואז DMEM לריכוז הרצוי. הוסף תוספי תזונה מתאימים לצינור, בהתאם לדרישות של קו התא הספציפי בעדינות לערבב את התאים על ידי הטיית הצינור חרוט פעמיים עד שלוש פעמים.
שאפו ציפוי למינין מצלחת של 24 באר ושטוף אותו פעם אחת עם PBS. שאף PBS. ולהחיל פתרון תא על כל באר בתנועה איור שמונה כדי למנוע גושים.
בסיום ציפוי התאים, החזירו את הלוחית לאנקובטור שנקבע על 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. בקצרה מערבולת פתרון המניות של כתב מוות התא מוקדם ולהוסיף אותו ל בארות על פי הוראות כתב היד. חכה 20 דקות.
ואז תדמיין את התאים החיים והמתים על בארות מרובות תחתיות זכוכית. הארכת הדגירה פרוטאז מאפשר התרופפות של הרשת העצבית בתוך גיליון הרים של תאים. התוצאה היא מוות תאי מופחת בזמן הדיסוציאציה, כמו גם תוצאות התאוששות יעילה יותר בימים הבאים.
באמצעות הליך הדגירה המורחב של האנזים, התרבויות מציגות הכפלה משוערת של הכדאיות התאית בימים שלאחר ההתחדשות וצפיפות נמוכה יותר של תאים מתים או גוססים. שלב המעבר של הבידול העצבי מתרחש במשך מספר ימים, שבמהלכם התאים מבטאים בהדרגה סמנים עצביים בשלב מאוחר. סמנים אלה מזוהים מיד בתרבויות שהתרבו לאחר ארבעה שבועות של התברואה מוקדמת.
פרוטוקול הפרוטאז המורחב גם משפר במתינות את הצמיחה של הנוירידים. הן אורך neuride הכולל ואת הצמיחה דנדריט משופרים. Replating שימושי גם ללימוד סינפסות.
שבוע בלבד לאחר ההצבה, נצפו סמנים לחלבונים לפני ואחרי הסינפטיה. יתר על כן, פעילות חשמלית של דפולריזציה ספונטנית וארמים מונעים סינפטית ניתנת לגילוי באמצעות הדמיית סידן או מערכים רב-חשמליים. הליך חזור זה יכול להיות מותאם לסוגים רבים של יישומים.
בנוסף סינון תוכן גבוה כדי לזהות תרכובות טיפוליות פוטנציאליות, זה יכול לשמש הדמיה קונוסים צמיחה או הקלטות מערך multielectrode. דיסוציאציה מכנית של נוירונים שכבר יצרו תהליכים ארוכים היא מלחיצה. דגירה אנזימטית מוארכת וגירוי עדין של תאים הם צעדים חיוניים להצלחת הליך זה.
