פרוטוקול זה יכול לענות על האופן שבו מעגלים שונים במוח מווסתים נוירוגנזה למבוגרים ובמיוחד כיצד מעגלים עצביים מגרה או מעכבים משפיעים על התפשטות תאי גזע עצביים בוגרים. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מסוגלת למקד באופן ספציפי את המעגלים העצביים הרצויים, כמו גם להפחית את כמות הלחץ שהוכנס לבעלי החיים. שיטה זו יכולה לספק תובנה כיצד מעגלי מוח שונים לווסת נוירוגנזה למבוגרים, בפרט, כיצד סוגי תאים ספציפיים המשחררים נוירוטרנסמיטורים מסוימים לווסת את התפשטות תאי גזע עצביים למבוגרים.
כדי להתחיל בהליך זה, מקם את מקטעי הרקמה ב- PBS והתלה חמישה עד שמונה חלקים על שקופית טעונה באופן חיובי בסדר סידורי מהחלקה הראשונה לחלק האחורי. תן את חלקי הרקמה להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד חמש דקות לחלוטין לדבוק שקופיות. לאחר מכן, הכן מאגר ציטראט בגורם מכיל.
מחממים את חיץ ציטראט במיקרוגל במשך חמש דקות עד שהתסכול רותח. בינתיים, מניחים את החלקים המותקנים במחזיק מגלשת זכוכית. לאחר חמש דקות, מקם בזהירות את מחזיק השקופיות עם המקטעים לתוך תיבת פיפטה.
הגדר את כוח תנור המיקרוגל ל-50% ואת זמן הבישול לשבע דקות. הפעל שעון זמן למשך שבע דקות ונטר את הפתרון. עוצרים את מיקרוגל כאשר הפתרון מתחיל לרתיחה, וממשיכים את המיקרוגל לאחר עצירות רותחים.
עצור לאחר טיימר נגמר, גם אם זמן הבישול על המיקרוגל לא סיים. מטרת צעד זה היא לשמור על המים ממש מתחת לטמפרטורה רותחת מבלי לתת למים לרתיחה יתר על כן. יותר מדי רתיחה תסיר מקטעי רקמה מהשקופית.
לאחר מכן, מעבירים את הקופסה החמה עם חיץ ציטראט ושקופיות רקמות לדלי קרח לקירור. מכסים את התיבה, ומחכים כ -30 דקות או עד שהפתרון קריר למגע, לפני שתמשיך לכתם אנלוגי תימידין. כדי להכתים את חלקי הרקמה עם אנלוגי תימידין, להסיר את חלקי הרקמה ממאגר ציטראט.
תן לחלקי הרקמה להתייבש ולדבוק לחלוטין במגלשות, לפני ציור גבול עם עט הידרופובי. לאחר מכן, לחלחל את הסעיפים עם חיץ permeabilization במשך 20 עד 30 דקות. לשטוף את החלקים פעמיים באמצעות TBS-טריטון במשך חמש דקות בכל פעם.
לאחר מכן, הכינו פתרון תגובה של Edu. הדגירה את החלקים בתסומה התגובה Edu במשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, לשטוף אותם שלוש פעמים TBS-טריטון במשך חמש דקות בכל פעם.
מכסים את השקופיות בנייר אלומיניום, או מניחים אותן בתא מוגן באור כדי להגן מפני אור לאחר שלב זה. בשלב זה, בדוק אם תגובת Edu פועלת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים המסווים ב-Edu יש לראות אם התגובה עובדת.
עכשיו, לחסום את חלקי הרקמה רכוב באמצעות חיץ חסימה הרים באותה חיה כמו הנוגדן המשני במשך 30 דקות עד שעה. לאחר מכן, לשטוף אותם פעמיים TBS-טריטון במשך חמש דקות בכל פעם. במהלך שלב החסימה, הכינו את פתרון הנוגדנים העיקרי על ידי ערבוב הנוגדן העיקרי בחסימת המאגר.
לאחר מכן, להוסיף 250 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני לכל שקופית כדי להבטיח את חלקי הרקמה שקועים לחלוטין, ו דגירה אותם לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, לשטוף את חלקי הרקמה שלוש פעמים TBS-טריטון במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר נוגדן ראשוני עודף. לאחר מכן, הדגירה את חלקי הרקמה בנוגדן משני נדמדור פלואורופור מוכן בחסימת פתרון חיץ במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
לשטוף את חלקי הרקמה שלוש פעמים TBS-טריטון במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר נוגדן משני עודף. לאחר מכן, יש למרוח ת פתרון DAPI של 300 מיקרומולרים ב-1 עד 100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את חלקי הרקמה שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד כדי להסיר DAPI עודף, ולהסיר את מעגל העט PAP סביב הרקמה באמצעות ספוגית כותנה.
תן לסעיפים להתייבש, לפני החלת מדיה הרכבה וכיסוי אותם עם כיסויים. באמצעות תוכנת ההדמיה, פתח את התמונה של כל מקטע gyrus שקע כתמונה מורכבת עם הערוצים ממוזגים בצבעים שונים כדי לדמיין בקלות את colocalization. לאחר מכן, למדוד את האזור של gyrus שקע בכל קטע באמצעות כלי בחירת מצולע, ולהקליט את כל החלקים של כל עכבר.
זה יהיה האזור של gyrus שקע המשמש לחישוב הצפיפות. באמצעות מונה תא תוסף התוכנה נמצא תחת תוספים, לנתח, מונה תאים, מונה תאים, להקליט את מספר התאים gyrus שקע כי יש colocalizing הנוגדן העיקרי ו Edu אנלוגי תימידין מהתמונה המשולבת. בנוסף, רשום את המספר הכולל של תאים חיוביים Edu ו- nestin חיובי עם תהליך רדיאלי.
במקרה של קנן, חשוב מאוד לשים לב למורפולוגיה של התאים. אם כימות תאי גזע עצביים, ודא כי רק תאים עם תהליך רדיאלי הם לכמת. הזן את ספירת התאים בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לאסוף את כל הנתונים לניתוח במועד מאוחר יותר.
לדוגמה, כדי להשיג את צפיפות תאי הגזע, לחלק את הסכום של תאים חיוביים nestin ו Edu חיובי על ידי הסכום של נפח gyrus שקע בכל בעל חיים. חשב את אמצעי האחסון של כל מקטע על-ידי הכפלת האזור במרווחי Z-step כוללים, בהנחה שכל שלב הוא מיקרומטר אחד. בפרוטוקול זה, סה"כ הצעדים צריכים להיות קרובים ל -40 מכיוון שהרקמות חתוכים ב-40 מיקרומטר.
לאחר מכן, לחשב את המספר הכולל של תאים מתרבים, אחוז של תאי גזע עצביים מתרבים, ואת התאים מתרבים הכולל לאחר גירוי תאים טחבים מנוגדים. על ידי שימוש Edu אנלוגי thymidine ואחזור אנטיגן עבור כתמי קן, תאי גזע עצביים מתרבים היו מסומנים בהצלחה. בנוסף, על ידי השמטת שלב אחזור אנטיגן, Tbr2 חיובי עצבי progenitor ו neuroblast ו DCX חיובי נוירובלסט נוירונים לא בוגרים היו מסומנים.
הנה דוגמה של האזור לכמת ו משמש לחישוב צפיפות התא, והנה דוגמה של הרקמה רכוב על שקופית. הן ניסויים מוצלחים והן ניסויים תת-נקובים מוצגים להשוואה. לבסוף, ישנם מספר כימות שונים שניתן להשיג מניסוי מוצלח.
הכימות כוללים את הצפיפות של תאי גזע עצביים מתרבים, אחוז תאי הגזע העצביים המתרבים, התאים המתרבים הכוללים ומאגר תאי הגזע הכולל. עם גירוי קונטרלטראלי של תאים טחבים, נצפתה ירידה בהתפשטות תאי גזע עצביים. הצעד החשוב ביותר בהליך זה הוא לשלוט רקמה רותחים במיקרוגל.
חלקי הרקמה ייפגעו אם הם רותחים במשך זמן רב מדי. לאחר ביצוע הליך זה, אפשר להזריק וקטורים ויראליים שונים כדי למקד את אותו מעגל. לדוגמה, אם אחד היה מגרה מעגל עצבי, אפשר לעכב אותו באמצעות וירוס DREADD מעכבות.
הטכניקות המוצגות בפרוטוקול זה אינן חדשניות. עם זאת, כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא מכסה באופן מקיף את כל השלבים הדרושים למענה על שאלות על איך המעגל משפיע נוירוגנזה למבוגרים.
